Question

下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料，请分析回答下列问题。

【资料1】巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达【5’AOX1和3’AOX1（TT）分别是基因AOX1的启动子和终止子】。

【资料2】巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以科学家改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。

（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A和B位置接上             、            限制酶识别序列， 这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化。

（2）酶切获取HBsAg基因后，需用                将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取                。

（3）步骤3中应选用限制酶            来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。

（4）为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用                    方法进行检测。

（5）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入            以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。

（6）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行                并分泌到细胞外，便于提取。

Answer

（1）SnaB    AvrⅡ   （2）DNA连接酶     大量重组质粒  （3）BglⅡ

（4）DNA分子杂交    （5）甲醇          （6）加工（修饰）

【解析】（1）为了避免质粒和目的基因自身环化，应选择双酶切，目的基因应插入在启动子和终止子之间，所以应在HBsAg基因两侧的A和B位置接上SnaB和AvrⅡ限制酶识别序列。

（2）连接两个DNA片段的酶是DNA连接酶；将重组质粒导入大肠杆菌的目的是进行复制，以获取大量的重组质粒。

（3）切割后形成的黏性末端包括5’AOX1和3’AOX1，则选择的限制酶应是BglⅡ。

（4）检测受体细胞中是否含有目的基因，其方法是DNA分子杂交法。

（5）巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源。

（6）细菌没有内质网和高尔基体，而酵母菌是真核生物，有内质网和高尔基体，能够对分泌蛋白进行加工修饰。