Question

（6分）请回答PCR方面的有关问题：

(1)引物是扩增过程中必须加入的物质，从化学本质上说，引物是一小段_______________。

(2)引物是子链合成延伸的基础，如下图。

从理论上推测。第四轮循环产物中两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段所占DNA总数的比例为         。

(3)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的一组引物(只标注了部分碱基序列)不合理(如下图)，请说明理由                                 。

（4）在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是                         。

（5）假如引物都用³H标记，从理论上计算，所得DNA分子中含有³H标记的占          。

（6）与体内DNA复制相比，PCR反应体系除引物外，还需加入哪种特别的物质？        。

Answer

（6分）(1)DNA或RNA  （2）50%

(3)引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效

（4）从子链的5′端向3′端延伸（5）100％（6）Taq 酶

【解析】基因扩增中引物通常是一小段DNA或RNA片段，第二轮中含引物II（或考题中的引物A）比例为3/4，第三轮中占7/8，即所有DNA片段中，只有一个片段不含引物II，故推测在第四轮中，含引物II（或引物A）的比例为15/16。与两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段所占DNA总数的比例为50%，由于题图中的引物A和引物B均不在该片段的端点，因此第一轮循环后，得到的两DNA片段中两条脱氧核苷酸链都不等长，通过自行绘图可推知，第二轮中亦不会出现等长的引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：

1、引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。

2、引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

4、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

5、引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

6、引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。

PCR技术扩增DNA需加入特定的Taq酶。复制过程子链的合成方向是从子链的5′端向3′端延伸