Question

融合蛋白是通过DNA重组技术将两个或多个基因的编码区首尾连接，由同一调控序列控制合成的蛋白质。人的表皮生长因子受体（EGFR）是影响癌症发生发展的重要因素，它在肺癌、脑肿瘤等实体瘤中均有大量表达。天花粉蛋白（TCS）是重要天花粉的有效成分，具有抗肿瘤作用。下图是通过基因工程方法将人表皮生长因子基因（EGF）和TCS基因连接起来，利用大肠杆菌生成人表皮生长因子—天花粉蛋白融合蛋白的过程示意图。请回答：

（1）为了建立含有EGF的cDNA文库，应从健康人体的               细胞中提取总mRNA，通过  法合成cDNA。从cDNA文库中提取的EGF的长度比从基因组文库中提取的EGF短。利用         技术可以大量扩增EGF，该技术所利用的原理是                               。

（2）在①过程中，应使用的限制酶是                       ，在融合蛋白基因的首端还应

插入                   ，它是                          识别和结合的位点。

（3）在②过程中，首先用_________________处理大肠杆菌，使其转变为_________________细胞。

（4）应用___________________        _技术可检测大肠杆菌是否表达出融合蛋白。

（5） 单纯使用天花粉蛋白治疗癌症疗效甚微，而人表皮生长因子——天花粉蛋白融合蛋白疗效显著，其原因是                                                              。

（6）某同学为了筛选插入目的基因的表达载体，将处理过的载体分别置于含有氨苄青霉素和四环素的培养基上培养，观察其增殖和表达情况。此设计方案是否合理，            请说明理由                                                                          。

Answer

（每空1分，共13分）

（1）表皮      反（逆）转录          PCR     DNA双链复制

（2）BamHⅠ和SphⅠ       启动子       RNA聚合酶

（3）Ca2+      感受态

（4）抗原--抗体杂交     （5）人表皮生长因子能与肿瘤细胞表面的受体(EGFR)特异性结合，从而使天花粉蛋白定向的作用于肿瘤细胞。

（6）不合理     表达载体不能在培养基上增殖和表达，只有导入大肠杆菌，才能增殖和表达。

【解析】

试题分析：

（1）健康人体的表皮细胞中提取总mRNA，通过反（逆）转录法合成cDNA，可建立含有EGF的cDNA文库。利用PCR技术可以大量扩增EGF，原理是DNA双链复制。

（2）在①基因表达载体构建的过程中，据图分析，目的基因必需使用的限制酶是BamHⅠ和SphⅠ，在融合蛋白基因的首端还应插入启动子，它是RNA聚合酶识别和结合的位点，能驱动基因转录出信使RNA，最终获得所需要的蛋白质。

（3）在②将目的基因导入受体细胞的过程中，首先用Ca2+处理大肠杆菌，使其转变为感受态细胞。

（4）检测大肠杆菌是否表达出融合蛋白，应采用抗原--抗体杂交技术。

（5） 单纯使用天花粉蛋白治疗癌症疗效甚微，而人表皮生长因子——天花粉蛋白融合蛋白疗效显著，其原因是人表皮生长因子能与肿瘤细胞表面的受体(EGFR)特异性结合，从而使天花粉蛋白定向的作用于肿瘤细胞。

（6）为了筛选出含有目的基因的表达载体，应该其导入大肠杆菌，分别置于含有氨苄青霉素和四环素的培养基上培养，观察增殖和表达。由于氨苄青霉素的抗性基因结构和功能完整，则含有受体目的基因的受体细胞在氨苄青霉素的培养基上能够繁殖；而目的基因的插入破环了四环素抗性基因，则在四环素的培养基上不能繁殖。

考点：基因工程。