Question

常见的酿酒酵母只能利用葡萄糖而不能利用木糖，自然界中一些酵母菌能分解木糖产生酒精，但对酒精的耐受能力较差。下面是利用木糖发酵产生酒精的酿酒酵母的培育过程，请分析回答下列问题。

(1)将自然界中采集到的葡萄带回实验室，用      将葡萄皮上的微生物冲洗到无菌的三角瓶中，瓶中的液体经适当稀释后，用      (方法)接种于固体培养基上，在适宜的条件下培养，获得各种菌落。

(2)将培养基上的酵母菌菌株转接到以木糖为唯一碳源的培养基中，无氧条件下培养一周后，有些酵母菌死亡，说明这些酵母菌           。从存活的酵母菌中提取DNA，并用PCR技术大量扩增目的基因。

(3)将目的基因连接到一种穿梭质粒(可以在大肠杆菌中复制和在酿酒酵母中表达的质粒)上。该质粒具有两种标记基因，即氨苄青霉素抗性基因和尿嘧啶合成酶基因。大肠杆菌被该质粒转化后，应接种于含    的培养基上进行筛选。将质粒导入酵母菌时，由于氨苄青霉素不能抑制酵母菌繁殖，应选择缺乏      能力的酿酒酵母作为受体菌。

(4)对转基因酿酒酵母发酵能力进行测试，结果如图所示：

据图分析，将转基因酿酒酵母接种在以      为碳源的培养基中进行发酵能力测试，最初培养基中的    糖被快速消耗，随着发酵继续进行，转基因酿酒酵母能够              ，说明所需菌株培育成功。

Answer

(1)无菌水 稀释涂布平板法

(2)不能利用木糖发酵(或缺乏木糖发酵途径)

(3)氨苄青霉素 尿嘧啶合成

(4)葡萄糖和木糖 葡萄 利用木糖产生酒精，并且酒精浓度升高对木糖发酵无明显影响

【解析】(1)采集菌种时，需用无菌水冲洗获得微生物菌体，菌液经稀释后接种于固体培养基上的方法只能是稀释涂布平板法。

(2)培养基中的碳源只有木糖，不能分解木糖的微生物不能生存，因此死亡的都是不能利用木糖发酵(或缺乏木糖发酵途径)的微生物。

(3)氨苄青霉素能够抑制细菌的繁殖而不能抑制酵母菌的繁殖，因此大肠杆菌被该质粒转化后，就获得了抗氨苄青霉素的能力，可以利用含氨苄青霉素的培养基进行筛选。而将该质粒导入酵母菌时，由于氨苄青霉素对酵母菌无抑制作用，因此只能利用缺乏尿嘧啶合成能力的酿酒酵母作为受体(导入该质粒后获得了合成尿嘧啶的能力)，可以利用不含尿嘧啶的培养基进行选择培养。

(4)由图可知，检测的结果既有葡萄糖又有木糖，因此转基因酿酒酵母是接种在以葡萄糖和木糖为碳源的培养基中进行发酵能力测试的。由曲线变化可知，培养基中最先大量减少的是葡萄糖，当葡萄糖不足时，木糖大量减少，说明转基因酿酒酵母利用木糖产生酒精，并且酒精浓度升高对木糖发酵无明显影响。