Question

科学家将鱼抗冻蛋白基因转入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，可以在相对寒冷的环境中生长。质粒上有Pst I、Sma  I、Hind Ⅲ、Alu I等四种限制酶切割位点，下图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图（amp^r为抗氨苄青霉素基因），其中①～④是转基因抗冻番茄培育过程中的相关步骤，Ⅰ、Ⅱ表示相关结构或细胞。请据图回答：

（1）在构建基因表达载体时，为了避免目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，在此实例中，应该选用限制酶_____________分别对________________进行切割，切割后产生的DNA片段分别为_____和_________种。

（2）培养基中的氨苄青霉素会抑制番茄愈伤组织细胞的生长，要利用该培养基筛选含鱼的抗冻蛋白基因的番茄细胞，应使基因表达载体I中含有__________作为标记基因。

（3）通常采用__________________技术，在分子水平检测目的基因是否翻译形成了相应的蛋白质。

（4）利用组织培养技术特含鱼的抗冻蛋白基因的番茄组织细胞培育成植株。图中③、④依次表示组织培养过程中番茄组织细胞的______________________________过程。

Answer

（1）Pst I和Sma I 含鱼抗冻蛋白基因的DNA、质粒 4 2

（2）氨苄青霉素抗性基因

（3）抗原－抗体杂交

（4）脱分化、去分化

【解析】

试题分析：（1）Alu I切割会破坏目的基因，不能用；目的基因所在DNA片段无Hind Ⅲ切割位点，不能用；都用Sma I或都用Pst I切割会生成相同末端发生任意连接，故应该选用限制酶Pst I和Sma I分别对含鱼抗冻蛋白基因的DNA、质粒进行切割，含鱼抗冻蛋白基因的DNA会生成4种不同DNA片段，而质粒2种。

（2）基因表达载体I中含有氨苄青霉素抗性基因，会表现出抗氨苄青霉素性状，成功导入基因表达载体番茄愈伤组织细胞在含氨苄青霉素的培养基能够正常生长。

（3）从转基因生物提取蛋白质，用相应抗体进行抗原－抗体杂交，如果会杂交带出现，表明目的基因已经形成蛋白质产品。

（4）图中③为高度分化植物体细胞形成未分化的愈伤组织过程，为脱分化；④表示愈伤组织形成幼根和芽过程，为再分化。

考点：基因工程、植物组织培养

【名师点睛】确定限制酶的种类

（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类

①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。

②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。

③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点）。

（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类

①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。

②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。