Question

为解除柑橘黄龙病对柑橘产业的严重影响，美国科学家近日从菠菜中获得了一种能抵抗柑橘黄龙病的蛋白质的基因，并已经成功地进行了一系列培育转基因植株的研究。其过程大致如下，请分析后作答。

（1）有两种识别切割序列完全不同的限制酶E和F从菠菜基因组DNA上切下目的基因并取代Ti质粒（4．0 kb）上相应的EF区域（0．2 kb）形成重组质粒，该过程还必须用到的酶是      ，形成的重组质粒      填（“能”或“不能”）被E酶切割。

（2）若图中Ti质粒上限制酶G切割位点与E的切割位点距离0．9 kb，限制酶H切割位点距F切割位点0．5 kb，分别用限制酶G和限制酶H酶切两份重组质粒样品，结果如下表。据此可判断目的基因的大小为      kb;并将目的基因内部的限制酶H切割位点标注在下图中。

G	H
1．8 kb 3．2 kb	1．3 kb 3．7 kb

（3）在上述培育过程中两次用到农杆菌，它与柑橘细胞相比较，在结构上最主要的区别是      ，导入重组质粒后的农杆菌的作用是      。

Answer

（1）DNA连接酶 能

（2）1．2 标记如图

（3）无核被膜包被的细胞核 感染植物，将目的基因转移到受体细胞中

【解析】（1）将两个DNA片段连接起来需要DNA连接酶；重组质粒中含有E酶的识别序列和切割位点，因此形成的重组质粒能被E酶切割。

（2）已知质粒pZHZ1的长度为3．7kb，其中EF区域长度为0．2kb，所以切去EF段后的质粒长度为3．7-0．2=3．5kb。现用限制酶G切割重组质粒pZHZ2样品，结果被酶G切割成1．6kb和3．1kb两个片段，可知重组质粒pZHZ2的总长度为1．6+3．1=4．7kb，所以目的基因长度为4．7-3．5=1．2kb。重组质粒中G的切割位点距E的切割位点0．8kb，单独用限制酶G切割后产生1．6kb和3．1kb两个片段，说明在重组质粒中除了图中标示出来的G酶识别位点外，还有一个G酶识别位点；H酶的酶切位点距F0．5kb，用H酶单独切后产生1．2kb和3．5kb两个片段，说明在重组质粒中含有一个H的酶切位点，根据题中信息提示“目的基因内部的酶G、酶H切割位点标注在图上”，可确定在EF之间分别含有G和H的一个识别位点。可断定G的识别位点，在距离E点右侧0．8kb处，H的识别位点在距F左侧0．7kb处，如下图所示:

（3）农杆菌属于原核生物，柑橘属于真核生物，原核细胞和真核细胞最主要的区别是，它与柑橘细胞相比较，在结构上最主要的区别是原核细胞无核被膜包被的细胞核，导入重组质粒后的农杆菌的作用是感染植物，将目的基因转移到受体细胞中。

【考点定位】基因工程的原理及技术。本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的概念、原理、操作步骤等，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能结合所学的知识准确答题。

【名师点睛】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。