Question

科研人员利用生物工程技术对干扰素基因缺失小鼠进行基因治疗，技术流程如图，分析回答

⑴步骤①的技术名称_________。

⑵将基因导入ES细胞而不是上皮细胞是因为____________。

⑶步骤③中，需要构建含有___________________的基因表达载体。之前利用PCR技术扩增目的基因，可以从图2的ABCD四种单链DNA片断中选取_______作为引物。对干扰素基因片断和质粒进行酶切时，可选用限制酶的组合为________________或_________。

⑷将步骤③获得的ES细胞在荧光显微镜下观察，选择发___________色荧光的细胞进行体外诱导。为检测干扰素基因是否表达，可以采用_________________________的方法。

Answer

核移植 ES细胞具有发育的全能性 干扰素基因 启动子 终止子 B和C HindⅢ和PstⅠ EcoRⅠ和PstⅠ 绿 抗原-抗体杂交

【解析】本题结合图形考查动物细胞核移植、胚胎工程、基因工程及其应用等知识，综合性较强；图1中①是体细胞核移植，②是早期胚胎培养，③是将目的基因导入受体细胞；图2是利用限制酶切取目的基因，图3是构建完成的基因表达载体，可据此分析答题。

（1）步骤①的技术名称体细胞核移植，形成重组细胞。

（2）相对于上皮细胞，ES细胞具有发育的全能性，因此该工程这应将目的基因导入ES细胞。

（3）步骤③是将目的基因导入受体细胞中，需要构建含有干扰素基因（目的基因）启动子、终止子的基因表达载体。利用PCR技术扩增目的基因（干扰素基因）时，由于子链延伸的方向是5，→3，，故需要从图2的ABCD四种单链DNA片断中选取B和C作为引物。对干扰素基因片断和质粒进行酶切时，要保证目的基因结构完整，同时还要避免连接时目的基因自身连接，以及保证重组质粒中至少保留一个完整的标记基因，故可选用HindⅢ和PstⅠ或EcoRⅠ和PstⅠ的限制酶组合。

⑷根据上述分析可知，关键完成的重组质粒中红色荧光蛋白基因已经被破坏，而绿色荧光蛋白基因的结构是完整的，故将步骤③获得的ES细胞在荧光显微镜下观察，选择发绿色荧光的细胞进行体外诱导。为检测干扰素基因是否表达，可以采用抗原-抗体杂交的方法。

【点睛】PCR技术扩增目的基因和基因工程操作步骤都是考试的重点，也是学生理解的难点，学生解题时极易失分，尤其是如何正确判断限制酶的选择，需要引起足够的重视，现举例如下：

(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类：

①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。

②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。

③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。

(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类：

①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。

②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因。