Question

下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料，请分析回答下列问题。

资料1：巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达【5’AOX1和3’AOX1（TT）分别是基因AOX1的启动子和终止子】。

资料2：巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以科学家改造出了如图所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。

（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A和B位置接上________________、 ____________限制酶识别序列， 这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化。

（2）酶切获取HBsAg基因后，需用____________将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取____________。

（3）步骤3中应选用限制酶____________来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。

（4）为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的细胞中HBsAg基因是否转录出mRNA，可以用____________方法进行检测。

（5）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入____________以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。

（6）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行____________并分泌到细胞外，便于提取。

Answer

(8分)

(1)SnaBⅠ AvrⅡ (2)DNA连接酶 大量重组质粒（重组质粒不得分） (3)BglⅡ

(4)DNA分子杂交 (5)甲醇 (6)加工(修饰)

【解析】(1)重组质粒上的目的基因若要表达，目的基因的首端和尾端需含有启动子和终止子。而SnaBⅠ、AvrⅡ识别的序列在启动子与终止子之间，只要在目的基因两侧的A和B位置分别接上这两种序列，并用SnaBⅠ、AvrⅡ这两种限制酶对质粒和目的基因同时进行切割，便会各自出现相同的黏性末端，便于重组与表达，同时可防止自身环化，因此在HBsAg基因两侧的A和B位置应接上SnaBⅠ和AvrⅡ限制酶的识别序列。

(2)用DNA连接酶可将切割后的HBsAg基因和pPIC9K质粒连接成重组质粒；将重组质粒导入大肠杆菌体内的目的是：利用大肠杆菌的无性繁殖，短时间内获取大量的重组质粒。

(3)重组DNA的两侧分别是启动子和终止子，除BglⅡ外，其他限制酶均会破坏含有启动子、终止子的目的基因。所以步骤3中应选用限制酶BglⅡ来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。

(4)可用DNA分子杂交技术检测巴斯德毕赤酵母菌内是否导入了目的基因。

(5)资料1显示，甲醇为该酵母菌的唯一碳源，同时可诱导HBsAg基因表达，据此可知：转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。

(6) 大肠杆菌等细菌为原核生物，细胞内没有对分泌蛋白进行加工修饰的内质网和高尔基体，而巴斯德毕赤酵母菌为真核生物，其细胞内有内质网和高尔基体等复杂的细胞器。所以与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行加工修饰并分泌到细胞外，便于提取。

【考点定位】基因工程、微生物的培养、原核细胞与真核细胞。