Question

为研究野生型拟南芥抗盐机理，研究人员利用T-DNA插入拟南芥基因组中，得突变体Y。

（1）种植野生型拟南芥，将地上部分浸入______菌悬浮液中以实现转化，该菌的T-DNA上需带有抗除草剂基因以便筛选。在适宜条件下培养，收获种子（称为T₁代）。

（2）假设所处理植株为T-DNA单拷贝插入，则T₁代植株自交后所结种子中具有抗除草剂性状的占______。继续种植具有抗除草剂性状的种子，长成植株后进行自交，若______，表明获得了纯合的转基因突变体植株Y。

（3）野生型拟南芥的抗盐性状与D基因密切相关，T-DNA插入到D基因中，致使该基因失活，失活后的基因记为d。收集上述突变体Y叶片并提取DNA，分别用引物“LB+RP”组合及“LP+RP”组合进行PCR扩增。已知插入完整T-DNA后，“LP+RP”不能完成PCR扩增如图．检测扩增结果中，若______，则相应植株的基因型为Dd；若______，则相应植株的基因型为dd。

（4）研究人员收集7个突变体的叶片，提取叶片总mRNA，并逆转录为cDNA，利用特异性引物进行PCR扩增，结果如图．基因actin在拟南芥中表达相对稳定，作为本实验的______，结果表明______号植株因T-DNA的插入，D基因完全沉默。

（5）将野生型和突变体种子消毒后，分别播种于含有不同浓度NaCl培养基中，观察种子萌发情况，结果见如图．

由如图可知，在不含NaCl的培养基上，野生型和突变体种子的萌发率______；随着NaCl浓度的升高，突变体种子的萌发率明显______。

（6）野生型在高浓度NaCl胁迫下，脱落酸（ABA）含量增加，并迅速参与到抗胁迫的反应中。突变体D基因由于T-DNA的插入不能正常表达，导致突变体的抗盐性下降，由此推测D基因抗盐作用的机理是______。

Answer

农杆 3/4 全部具有抗除草剂性状 “LB+RP”组合和“LP+RP”组合均能进行PCR扩增 “LB+RP”组合能扩增，“LP+RP”组合不能扩增 参照或标准 5 没有明显差异 下降 D基因的表达会促进ABA的合成，从而提高抗盐能力

【解析】

基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）研究人员利用T-DNA插入拟南芥基因组中，T-DNA是农杆菌质粒的组成，所以种植野生型拟南芥，将地上部分浸入农杆菌悬浮液中以实现转化，该菌的T-DNA上需带有抗除草剂基因以便筛选。在适宜条件下培养，收获种子。

（2）假设所处理植株为T-DNA单拷贝插入，则T1代植株基因型为杂合子，自交后所结种子中具有抗除草剂性状的占3/4，继续种植具有抗除草剂性状的种子，长成植株后进行自交，若全部具有抗除草剂性状或没有性状分离，表明获得了纯合的转基因突变体植株Y。

（3）已知T-DNA插入到D基因中，致使该基因失活，失活后的基因记为d，由图示引物的位置可知，若检测扩增结果中，若“LB+RP”组合和“LP+RP”组合均能进行PCR扩增，则相应植株的基因型为Dd；若“LB+RP”组合能扩增，“LP+RP”组合不能扩增，则相应植株的基因型为dd。

（4）基因actin在拟南芥中表达相对稳定，作为本实验的参照或标准，结果表明5号植株因T-DNA的插入，使其没有表达出D基因的产物，即D基因完全沉默。

（5）由图3可知，在不含NaCl的培养基上，野生型和突变体种子的萌发率没有明显差异；随着NaCl浓度的升高，突变体种子的萌发率明显下降。

（6）野生型在高浓度NaCl胁迫下，脱落酸（ABA）含量增加，并迅速参与到抗胁迫的反应中。突变体D基因由于T-DNA的插入不能正常表达，导致突变体的抗盐性下降，由此推测D基因抗盐作用的机理是D基因的表达会促进ABA的合成，从而提高抗盐能力。