Question

自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题：

(1)实验步骤

①制备稀释倍数为10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶的系列稀释液。

②为了得到更加准确的结果，应选用________________________法接种样品。

③适宜温度下培养。

(2)结果分析

①测定大肠杆菌数目时，在对应稀释倍数为10⁶的培养基中，得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是__________。

A.一个平板，统计的菌落数是230

B.两个平板，统计的菌落数是220和260，取平均值240

C.三个平板，统计的菌落数分别是400、212和256，取平均值289

D.四个平板，统计的菌落数分别是210、260、240和250，取平均值240

②一同学在稀释倍数为10⁶的培养基上测得平板上菌落数的平均值为212，那么每毫升样品中的菌落数约是(涂布平板时所用的稀释液体积为0.2 mL)_________________________个。

③用这种方法测定菌体密度时，实际活菌数量要比测得的数量__________(填“多”或“少”)，因为______________________________________________________________。

(3)自来水中的大肠杆菌数目少，为了测定其数目，采用的测定方法是____________________。根据该方法计数大肠杆菌数目时，其培养基中常加入伊红美蓝。计数基本原理是__________________________

Answer

稀释涂布平板 D 1.06×109 多 当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 滤膜法 将已知体积的水过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养基上培养，在培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色，根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量

【解析】

1、平板划线法是接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，在数次划线之后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的子细胞群体-菌落；稀释涂布平板法是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同梯度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基上，进行培养获得由单细胞繁殖而来的菌落。 
2、对微生物进行分离、计数常用的接种方法是稀释涂布平板法，估算每毫升样品中的细菌数时，往往选取30～300的平板，取至少三个平板的平均值，每毫升样品中的细菌数=（平板的平均菌落数÷涂布的体积）×稀释的倍数；由于当两个或多个细胞连在一起时平板上观察的是一个菌落，因此估算的菌落数少于实际菌落数。

（1）接种微生物常用平板划线法和稀释涂布平板法，其中稀释涂布平板法可用于微生物的计数，因此为了得到更加准确的结果，应选用稀释涂布平板法接种样品。

（2）①测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，由于在设计实验时，一般要涂布至少三个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性；并且为了保证结果准确，一般选择菌落数在30-300的平板计数，因此D选项的结果最可靠。即D正确，ABC错误。
②在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为212，涂布平板时所用稀释液的体积为0.2mL，因此每毫升样品中的菌落数是212÷0.2×106=1.06×109。
③当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察的是一个菌落，因此用这种方法测定得密度偏低，实际活菌数量要比测得的数多。

（3）自来水中的大肠杆菌数目少，为了测定其数目，采用的测定方法是滤膜法。将已知体积的水过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养基上培养，在培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色，根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。