Question

Rag₂基因缺失小鼠不能产生成熟的淋巴细胞。科研人员利用胚胎干细胞(ES细胞)对Rag₂基因缺失小鼠进行基因治疗。其技术流程如下图：

(1)步骤①中所选的卵母细胞应处于________________________期。

(2)步骤②中，重组胚胎培养到囊胚期时，可从其________________分离出ES细胞，ES细胞在形态上表现为_____________________________的特点。

(3)步骤③中，需要构建含有Rag2基因的__________________。可以根据Rag2基因的核苷酸序列设计合成_____________，利用_______________技术扩增Rag2基因片段。用HindⅢ和PstⅠ限制酶分别在目的基因所在DNA片段两侧进行酶切获得Rag2基因片段。为将该片段直接连接到表达载体，所选择的表达载体上应具有_________________酶的酶切位点。

Answer

（1）减数第二次分裂中（MⅡ中）

（2）内细胞团 体积小、细胞核大、核仁明显

（3）表达载体（重组质粒） 引物 PCR Hind Ⅲ和PstⅠ

【解析】

（1）步骤①为核移植，所选的卵母细胞应处于减数第二次分裂中（MⅡ中）。

（2）重组胚胎培养到囊胚期时，可从其内细胞团中分离出ES细胞，ES细胞在形态上表现为体积小、细胞核大、核仁明显。

（3）步骤③中表示将Rag2基因（目的基因）导入ES细胞（受体细胞），此过程需要构建含有Rag2基因的表达载体（重组质粒）。设计引物要遵循碱基互补配对原则，所以根据Rag2基因的核苷酸序列进行设计。可利用PCR技术扩增Rag2基因片段。Rag2基因片段是用HindⅢ和PstⅠ限制酶切割获得，所以表达载体上应具有HindⅢ和PstⅠ酶的酶切位点。