Question

Rag2基因缺失小鼠不能产生成熟的淋巴细胞。科研人员利用胚胎干细胞（ES细胞）对Rag2基因缺失小鼠进行基因治疗。其技术流程如图：

请回答：

（1）该技术流程所涉及的生物工程技术有_________________。

①动物细胞培养    ②细胞核移植   ③胚胎干细胞的分离与培养   ④转基因   ⑤动物细胞融合

（2）在步骤①前，应采用______________普遍使用的方法）对卵母细胞进行处理。

（3）ES细胞在功能上的特性是______。在体外培养时，在培养液中添加____，就可以诱导ES细胞向造血干细胞分化。

（4）左图表示含有Rag2基因的DNA片段，右图表示pZHZ11质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ、SmaⅠ4种限制酶识别的碱基序列和切割位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、G↓AATTC、CCC↓GGG。

Rag2基因的获得可以从鼠的胎盘细胞中提取 ________，通过逆转录方法合成含Rag2基因的DNA片段。若将Rag2基因和如图的质粒连接形成重组质粒，那么应选用 _______限制酶切割，而后加入DNA连接酶进行连接。

（5）步骤③中，需要构建含有Rag2基因的表达载体。可以根据_____________设计引物，利用PCR技术扩增Rag2基因片段。

（6）为检测Rag2基因的表达情况，可提取治疗后小鼠骨髓细胞中的___________，用抗Rag2蛋白的抗体进行杂交实验。

Answer

①②③④ 显微操作去核法 有发育的全能性 分化诱导因子 mRNA BamHⅠ Rag2基因 蛋白质

【解析】

分析题图：图示是利用胚胎干细胞（ES细胞）对Rag2基因缺失小鼠进行基因治疗的过程图解，其中①表示核移植过程，②表示早期胚胎培养过程，③表示采用基因工程技术将目的基因导入受体细胞。

（1）该技术流程所涉及的生物工程技术有动物细胞培养、细胞核移植、胚胎干细胞的分离与培养和转基因。

（2）核移植是将体细胞核移植到去核的卵母细胞中，所以实验前要去除卵母细胞的细胞核，常用方法为显微操作去核法。

（3）ES细胞来源于早期胚胎或者原始性腺，它在形态上的特性是体积小、细胞核大、核仁明显；在功能上的特性是具有发育的全能性，即可以分化为成年动物体内任何一种组织细胞。在体外培养时，在培养液中添加分化诱导因子，如牛黄酸等化学物质时，就可诱导ES细胞向不同组织分化。

（4）要通过转录方法合成含Rag2基因的DNA片段，必须以Rag2基因转录的mRNA为模板，因此可以从鼠的胎盘细胞中提取Rag2基因的mRNA。能够获取目的基因并切开质粒的限制酶有识别序列为GGATCC，只有BamHⅠ的识别序列为GGATCC，因此选用BamHⅠ限制酶切割，而后加入DNA酶连接。

（5）将目的基因导入受体细胞时，需要先构建含有Rag2基因的表达载体（重组质粒）。可以根据Rag2基因的核苷酸序列设计合成引物，利用PCR技术扩增Rag2基因片段。

（6）为检测Rag2基因的表达情况，可采用抗原-抗体杂交法，即提取治疗后的小鼠骨髓细胞的蛋白质（抗原），用抗Rag2 蛋白的抗体进行杂交实验。