Question

如图为三种质粒和一个含目的基因的DNA片段，其中Ap^R为氨苄青霉素抗性基因，Tc^R为四环素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因，EcoR Ⅰ(0.7 kb)、Pvu Ⅰ(0.8 kb)等为限制酶切割位点，括号内的数据是该切点与复制原点的距离。已知1 kb＝1 000个碱基对，请回答下列问题：

(1)片段D为目的基因中的某一片段，则下列酶能形成或断裂图中②所示化学键的有_________(多选填字母)。

a、限制性核酸内切酶   b、DNA连接酶 c、Taq酶  d、解旋酶       e、DNA水解酶

(2)若想获得大量的目的基因，可采用________法进行扩增，含目的基因的DNA片段共经过______次循环后刚好能形成等长的目的基因片段，复制n次需要提供特异性引物对______对。

(3)图中作为目的基因运载体最理想的质粒是________(填“A”“B”或“C”)，请据图分析，其他两种质粒一般不能作为运载体的理由分别是________________________________

(4)用EcoR Ⅰ全酶切目的基因和质粒B形成的重组质粒，并进行电泳观察，可出现长度分别为1.1 kb和______kb的两个片段，或者长度分别为_________的两个片段(重组质粒上目的基因的插入位点与EcoR I的识别位点之间的碱基对忽略不计)。

(5)将分别用限制酶Pvu Ⅰ切开的质粒B溶液与目的基因溶液混合，加入DNA连接酶后，进行大肠杆菌受体细胞导入操作，则受体细胞的类型（对抗生素表现出抗性R或敏感性S，蓝白代表菌落颜色）包含________(多选填字母)。

A．Ap^R、蓝色　　　B．Ap^R、白色     C．Ap^S、蓝色        D．Ap^S、白色

Answer

abce PCR 3 2n-1 B 质粒A不含有标记基因；质粒C在用和目的基因相同的限制酶切割时，复制原点会被破坏，使该质粒无法进行复制 5.6 3.6 kb和3.1 kb ABD

【解析】

基因工程的工具：限制酶、DNA连接酶、运载体。

基因工程的操作步骤：目的基因的获取、构建基因表达载体、把目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。

含ApR、TcR的细胞表达后对氨苄青霉素、四环素存在抗性；lacZ为蓝色显色基因，故含有完整lacZ的细胞会显示蓝色，不含lacZ的细胞会显示白色。

D中①氢键、②磷酸二酯键。

(1)限制性核酸内切酶和DNA水解酶破坏②磷酸二酯键；DNA连接酶、Taq酶催化②磷酸二酯键的形成；解旋酶会破坏①氢键。故选abce。

(2)若想获得大量的目的基因，可采用PCR进行扩增，该过程需要耐高温的DNA聚合酶参与，需要2种引物，含目的基因的DNA片段共经过3次循环后才能形成等长的目的基因片段，每条新的子链延伸均需引物，故复制n次需要提供特异性引物对为：（2n+1-2）÷2=2n-1对。

(3)图中质粒A不含有标记基因；质粒C在用和目的基因相同的限制酶切割时，复制原点会被破坏，使该质粒无法进行复制，故不适合作为基因工程的运载体，作为目的基因运载体最理想的质粒是B，目的基因插入后不会破坏复制原点和ApR。

(4)由图可知，目的基因和质粒B只能用限制酶PvuⅠ进行切割，切割后目的基因的长度为4kb，其中含有的EcoR I的识别位点距离两端的PvuⅠ切点的距离分别是1kb或3kb；质粒上的PvuⅠ切点距离EcoR I的识别位点的最短距离是0.1kb，目的基因和质粒进行连接时可能正向连接或反向连接，故用EcoR Ⅰ全酶切目的基因和质粒B形成的重组质粒，并进行电泳观察，会出现长度分别为1.1 kb和5.6kb的两个片段，或者长度分别为3.6 kb和3.1 kb的两个片段。

(5)将分别用限制酶Pvu Ⅰ切开的质粒B溶液与目的基因溶液混合，加入DNA连接酶后，进行大肠杆菌受体细胞导入操作，则受体细胞的类型有未转化的细胞，不含ApR、lacZ，显示白色，ApS；转化的细胞有：只含目的基因的细胞，不含ApR、lacZ，显示白色，ApS；只含质粒B的细胞，含ApR、lacZ，显示蓝色，对氨苄青霉素有抗性；含重组质粒的细胞，含ApR、不含lacZ，表现为ApR、白色。故选ABD。