Question

回答下列（一）、（二）小题

（一）自生固氮菌是一类能独立固定氮气的细菌，其中有些好氧种类能产生 PHB（一种生物可降解的热塑性塑料）。现欲从活性污泥中分离、纯化、筛选出高产 PHB 的固氮菌，操作流程如下：采集土样→富集培养→分离、纯化培养→初步筛选 PHB 固氮菌→筛选高产 PHB 固氮菌→保存备用。请回答：

（1）富集培养时，为达到筛选自生固氮菌的目的，在配制培养液时不应添加________ 。培养时要将装有培养液的锥形瓶放置在__________上振荡培养，主要目的是为细菌的生长提供 ____________。

（2）用于筛选高表达量菌株的方法之一是经涂布分离获得______。涂布分离时用_______ 将菌液均匀涂布在培养基上，此时所使用的培养基与富集培养时有所不同，添加了一定量的_____________。

（3）在纯化过程中，在固体培养基上划线时，下列操作正确的是__________。

A．接种环采用 70%酒精灭菌  

B．接种时应在酒精灯火焰附近进行

C．划线时要将最后一区的划线与第一区的划线相连

D．划线分离时，需要把接种环深入到培养基中进行接种

（二）毛角蛋白11型中间丝（KIF II）基因与绒山羊的羊绒质量密切相关，获得转KIF II基因的高绒质绒山羊的简单流程如图：

（1）转基因过程用到的工具酶有_______________和____________。

（2）在过程②中，用________处理将皮肤组织块分散成单个成纤维细胞。由于人们对动物细胞所猫营养物质还没有完全搞清楚，因此在培养细胞时需在培养液中加入一定量的_________，在培养过程中，应将培养瓶宜于__________中培养。

（3）若要获得多只相同的转基因山羊，可对图中早期胚胎进行_________后进行胚胎移植。

（4）下列有关墓因工程的叙述，正确的是___________。

A．切割目的基因和载体DNA时为获得相同的枯性末端，必须用相同的限制性核酸内切酶

B．基因工程的原理是基因重组，其核心是上图中的过程④

C．图示过程获得的转基因绒山羊并不是克隆动物

D．重组表达载体上含有RNA聚合的的识别结合位点

Answer

含氮物质（氮源） 摇床 充足的氧气 单菌落 玻璃刮刀 琼脂糖 B 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 胰蛋白酶 动物血清 CO2培养箱 胚胎分割 D

【解析】

微生物分离方法主要有平板划线法和稀释涂布平板法，都是为了获得单菌落，所以经涂布分离可以获得单菌落，该过程需要倒平板制备固体培养基，需要添加凝固剂琼脂；转基因获得高绒质绒山羊过程中，需要用到限制性核酸内切酶和DNA连接酶，图中①表示构建基因表达载体，②表示胰蛋白酶处理成单个细胞，③表示用促性腺激素进行超数排卵处理，④表示核移植。

（一）（1）富集培养时，为达到筛选自生固氮菌的目的，在配制培养液时不应添加氮源。培养时要将装有培养液的锥形瓶放置在摇床上振荡培养，主要目的是为细菌的生长提供充足的氧气。

（2）用于筛选高表达量菌株的方法之一是经涂布分离获得单菌落。涂布分离时用玻璃刮刀将菌液均匀涂布在培养基上，此时所使用的培养基与富集培养时有所不同，富集培养是液体培养基，分离单菌落需要固体培养基，故添加了一定量的琼脂糖。

（3）在纯化过程中，在固体培养基上划线时，一定要注意严格无菌条件，其中接种环采用灼烧灭菌，A错误；接种时应在酒精灯火焰附近进行，B正确；划线时最后一区的划线与第一区的划线不能相连，C错误；划线分离时，需要把接种环接触到培养基表面进行接种，而不能深入到培养基中，D错误；故正确的是B。

（二）（1）①表示基因表达载体的构建过程，首先需要限制酶切割含有目的基因的DNA和运载体DNA，再用DNA连接酶连接目的基因和运载体形成重组质粒，故用到的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶。

（2）在过程②中，用胰蛋白酶处理将皮肤组织块分散成单个成纤维细胞。由于人们对动物细胞所猫营养物质还没有完全搞清楚，因此在培养细胞时需在培养液中加入一定量的动物血清，在培养过程中，应将培养瓶宜于CO2培养箱中培养。

（3）若要获得多只相同的转基因山羊，可对图中早期胚胎进行胚胎分割后进行胚胎移植。

（4）切割目的基因和载体DNA时为获得相同的枯性末端，一般用相同的限制性核酸内切酶，也可用两种限制性内切酶，A错误；基因工程的原理是基因重组，其核心是上图中的过程①，B错误；图示过程获得的转基因绒山羊，利用了核移植、早期胚胎培养、胚胎分割等技术，属于克隆动物，C错误；重组表达载体上含有RNA聚合的的识别结合位点，以起始转录，D正确；故正确的是D。