Question

下图1是获取用于构建基因表达载体的含人生长激素基因的DNA片段(DNA复制子链延伸方向是5′→3′，转录方向为左→右)示意图，图2是所用质粒示意图，其上的Amp^r表示青霉素抗性基因，Tet^t表示四环素抗性基因。有关限制酶的识别序列和酶切位点如下表。请据图回答：

限制酶识别序列和酶切位点表

限制酶	HindⅢ	BamHⅠ	PstⅠ	EcoRⅠ	SmaⅠ	BglⅡ
识别序列(5′→3′)	A^↓AGCTT	G^↓GATCC	C^↓TGCAG	G^↓AATTC	CCC^↓GGG	A^↓GATCT

(1) ①过程催化形成磷酸二酯键的酶有____________________，合成的人生长激素基因中________(选填“有”或“无”)与终止密码子相应的碱基序列。

(2) 引物1由5′→3′的碱基序列为________________________，引物2应含有限制酶________的识别序列；从图1的过程②开始进行PCR扩增，第六次循环结束时，图中用于构建基因表达载体的DNA片段所占比例是________。

(3) 在构建表达载体的过程中对图中质粒、DNA片段进行合适的完全酶切后，向两者的混合物中加入DNA连接酶，若只考虑DNA切段两两连接，则混合物中将形成________种环状DNA。

(4) 2018年11月基因编辑婴儿事件震惊了世界，舆论一片哗然，某科研团队利用“CRISPR/Cas9”技术将受精卵中的艾滋病病毒受体基因CCR5进行修改，拟培育出具有艾滋病免疫能力的基因编辑婴儿。下图3为向导RNA引导Cas9蛋白切割CCR5基因(目标DNA)示意图。

①向导RNA的合成需要________酶。Cas9蛋白是一种________酶。

②“GRISPR/Cas9”技术，是利用________法将Cas9蛋白和特定的引导序列导入受精卵中发挥基因编辑作用。

③基因编辑婴儿引起舆论的关注，很多科学家表示反对，请给出合理的理由______________。

Answer

反转录酶和DNA聚合酶 有 AGATCTGCATCCTCCAGG BamHⅠ 13/16 6 RNA聚合 限制 显微注射 细胞内DNA上可能不止一个Cas9酶识别和切割位点，可能导致脱靶

【解析】

据图2可推知，引物1序列应包含5′-GCATCCTCCAGG-3′，引物2序列应包含5′-ATCTCCCTGATG-3′，合成目的基因后需要用限制酶切割，由于目的基因中含有HindⅢ、PstⅠ切点，故用于构建基因表达载体时可选择的酶只剩下BglⅡ、BamHⅠ、EcoRⅠ、SmaⅠ，SmaⅠ会切割复制原点，不应选择，质粒中没有Ampr的切割位点，作为标记基因，同时要破坏Tett，因此为防止自身环化等情况出现，则应选择两种酶切割，故应选择的酶为BglⅡ、BamHⅠ，最终设计的引物应在两端加上特定的酶切位点，以便将合成的目的基因完整的切割下来。

（1）①过程表示逆转录过程，催化形成磷酸二酯键的酶有逆转录酶和DNA聚合酶，合成的人生长激素基因中有与终止密码子相应的碱基序列。

（2）据分析可知，引物1序列含GCATCCTCCAGG，引物2序列含ATCTCCCTGATG，在设计引物时，应在引物1的5′加上BglⅡ的酶切序列，在引物2的5′加入BamHⅠ酶切序列，因此引物1由5′→3′的碱基序列为AGATCTGCATCCTCCAGG，引物2应含有限制酶BamHⅠ的识别序列；从图1的过程②开始进行PCR扩增，第六次循环结束时，根据图示和PCR扩增技术的特点，可以推导出共有6个DNA的序列双链不等长，故图中可用于构建基因表达载体的DNA片段所占比例是1-6/26=13/16。

（3）在构建表达载体的过程中对图中质粒、DNA片段进行合适的完全酶切后，形成的含有2个酶切位点的片段有3种，向两者的混合物中加入DNA连接酶，若只考虑DNA切段两两连接，则混合物中将形成6种环状DNA。

（4）①向导RNA的合成需要RNA聚合酶。Cas9蛋白能切割CCR5基因，故Cas9蛋白是一种限制性核酸内切酶。

②将外源基因导入受精卵中应选择显微注射法，故“GRISPR/Cas9”技术，是利用显微注射法将Cas9蛋白和特定的引导序列导入受精卵中发挥基因编辑作用。

③基因编辑婴儿引起舆论的关注，很多科学家表示反对，原因是细胞内DNA上可能不止一个Cas9酶识别和切割位点，可能导致脱靶；此外，还存在其他的风险和违背当前的伦理道德。