Question

甲醇酵母菌是基因工程中常用的受体菌，研究人员将人的胶原蛋白基因导入甲醇酵母菌中并成功表达。请回答下列问题

（1）在构建基因表达载体时，用两种不同的限制分别切割目的基因的两端和质粒，使目的基因和质粒获得不同的黏性末端，其目的是___________________。目的基因与质粒连接时，需用________酶。

（2）甲醇酵母菌可高效表达外源蛋白质，但自身蛋白质分泌到培养基中的很少，这一特点的优点在于______________________，甲醇酵母菌分泌的胶原蛋白的结构与人的几乎完全相同，从细胞结构的角度分析，其原因可能是________________________。

（3）要使胶原蛋白基因在甲醇酵母菌中表达，需要先构建基因表达载体而不是直接将基因导人受体细胞，原因是_______________、___________________。

Answer

防止目的基因和质粒的自身环化、目的基因与质粒反向连接 DNA连接 便于目的蛋白的分离和纯化 甲醇酵母菌有内质网和高尔基体 目的基因无表达所需的启动子 目的基因无复制原点

【解析】

基因工程技术的基本步骤：

1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

4、目的基因的检测与鉴定：

（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。

（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）在构建基因表达载体时，为了防止目的基因和质粒的自身环化、目的基因与质粒反向连接，需要用两种不同的限制分别切割目的基因的两端和质粒，使目的基因和质粒获得不同的黏性末端；目的基因与质粒连接时，需用DNA连接酶。

（2）甲醇酵母菌可高效表达外源蛋白质，但自身蛋白质分泌到培养基中的很少，这样有利于目的蛋白的分离和纯化；甲醇酵母菌是真核生物，细胞中有内质网和高尔基体，可以对分泌蛋白进行加工和转运，因此甲醇酵母菌分泌的胶原蛋白的结构与人的几乎完全相同。

（3）由于获得的目的基因无表达所需的启动子，也无复制原点，因此要使胶原蛋白基因在甲醇酵母菌中表达，需要先构建基因表达载体而不是直接将基因导人受体细胞。