Question

科研人员研究E基因和F基因对拟南芥主根生长的影响。

（1）拟南芥是生命科学研究的模式生物，2000年底已经完成全部基因测序，基因测序需要构建拟南芥的______文库，理由是 ________。

（2）利用T-DNA转化拟南芥，PCR筛选E基因突变隐性纯合子（甲），原理及结果如图1.

据图分析，植株____________分别为野生型纯合子和E基因突变隐性纯合子。

（3）同样用上述方法筛选出F基因突变隐性纯合子（乙）。将甲和乙杂交，F₁的表现型为 _____ （填“野生型”或“突变型”）。F₁自交，若F₂中突变型的比例约为1/2，说明E基因和F基因在染色体上的位置关系是____，F₂中出现少量双突变体最可能的原因是___________ 。

（4）科研人员利用三种拟南芥研究F基因与主根生长的关系，结果如图2所示。据此推测F基因____。

（5）将绿色荧光蛋白(GFP)基因和F基因融合，构建表达载体，获得转基因拟南芥，荧光鉴定结果如图3，该结果不足以确定F蛋白位于细胞膜上。继续用高浓度蔗糖溶液处理液泡较小的转基因成熟荧光细胞，使其发生____，若观察到________ ，可证明F蛋白在细胞膜上。同时还需要补充一组__________作为对照。

（6）双分子荧光互补技术可研究细胞内蛋白质之间是否相互作用。将黄色荧光蛋白基因(YFP)分为2段（YFPN与YFPC），分别与已知抗原基因和该抗原的抗体基因融合构建表达载体，将两种载体同时导入拟南芥细胞，在515nm激发光下可发出黄色荧光。

①转基因拟南芥细胞能发出黄色荧光的原因是：_________会使YFPN与YFPC蛋白相互靠近。

②研究者推测E蛋白和F蛋白在细胞内形成二聚体后发挥作用。为验证该假设，请参照上述技术写出实验组的设计思路：____。

Answer

基因组（基因） 基因组文库理论上含有该生物的全部基因 1 3 野生型 位于一对同源染色体上 F1减数分裂过程中，E（e）基因和F（f）基因所在染色体发生交叉互换，形成同时含有e和f的配子（交叉互换产生同时含有E、F突变基因的重组型配子） （表达产物）抑制主根的生长 质壁分离 只有细胞膜部位有绿色荧光（荧光区域或面积逐渐缩小） 将含GFP基因的质粒导入拟南芥（其他处理同实验组） 抗原抗体的特异性结合 E基因和F基因分别与YFPN及YFPC基因融合，分别构建表达载体。将2个重组表达载体同时导入拟南芥细胞，在515mm激发光下观察是否可发出黄色荧光

【解析】

基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）拟南芥是生命科学研究的模式生物，2000年底已经完成全部基因测序，基因测序需要构建拟南芥的基因组文库，理由是基因组文库理论上含有该生物的全部基因。
（2）根据E基因结构和图甲结果可以看出，植株1通过PCR条带只有900一条，与基因E等长，说明该植株是野生型纯合子，同理判断植株3是E基因突变隐性纯合子。
（3）将甲和乙杂交，F1的表现型为野生型；F1自交，若F2中突变型（单突变体）的比例约为，说明E基因和F基因在染色体上的位置关系是位于一对同源染色体上，并且E与f位于一条染色体上，e与F位于另一条染色体上；F2中出现少量双突变体最可能的原因是F1减数分裂过程中，E（e）基因和F（f）基因所在的染色体发生交叉互换，形成同时含有e和f的配子（交叉互换同时产生E、F突变基因的重组型配子）。
（4）由图2可知，F基因（野生型）表达产物抑制主根生长的生长。
（5）将绿色荧光蛋白（GFP）基因和F基因融合，构建表达载体，获得转基因拟南芥，荧光鉴定结果如图3，该结果不足以确定F蛋白位于细胞膜上。继续用高浓度蔗糖溶液处理液泡较小的转基因成熟荧光细胞，使其发生质壁分离，若观察到只有细胞膜部位有绿色荧光，可证明F蛋白在细胞膜上。同时还需要补充一组将含GFP基因的质粒导入拟南芥细胞作为对照，以消除无关变量的影响。
（6）①转基因拟南芥细胞能发出黄色荧光的原因是：抗原抗体特异性结合会使YFPN与YFPC蛋白相互靠近。
②验证E蛋白和F蛋白在细胞内形成二聚体后发挥作用的实验组的设计思路：E基因和F基因分别与YFPN及YFPC基因融合，分别构建基因表达载体；将两个重组表达载体同时导入拟南芥细胞，在515nm激发光下观察是否可发出黄色荧光。