Question

凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：

（1）a、b均为蛋白质分子，其中先从色谱柱中洗脱出来的是________，原因是______________________________________。

（2）自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由______________替代。

（3）装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是__________________。

（4）若选用SephadexG－100，则“G”表示____________________，100表示___________________________。

（5）洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体________(填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是__________________。

Answer

a a相对分子质量大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快 尼龙网和尼龙纱 气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果 凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围 凝胶吸水值，即每克凝胶膨胀时吸水100g 相同 保持稳定

【解析】

血红蛋白的提取和分离：

1、实验原理：蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。

（1）凝胶色谱法（分配色谱法）：①原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。②凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

③分离过程：混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子
洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。④作用： 分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。

（2）缓冲溶液：①原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3—NaHCO3， NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。②缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。

(3）凝胶电泳法：①原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。②分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。③分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质—SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。

（1）a、b均为蛋白质分子，a相对分子质量大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快，故a先从色谱柱中洗脱出来。

（2）自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由尼龙网和尼龙纱等材料替代。

（3）凝胶色谱柱内有气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果，故装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在。

（4）SephadexG－100，“G”表示凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围；100表示凝胶吸水值，即每克凝胶膨胀时吸水100g。

（5）洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体相同，洗脱时，对洗脱液的流速要求是保持稳定。