Question

回答下列（一）（二）小题

（一）请回答从土壤中分离产脲酶细菌和脲酶固定化实验的有关问题

（1）LB固体培养基：取适量的蛋白胨、酵母提取物、NaCl，加入一定量的蒸馏水溶解，再加_________，灭菌备用。

（2）尿素固体培养基：先将适宜浓度的尿素溶液用_______灭菌过的G6玻璃砂漏斗过滤，因为G6玻璃砂漏斗________，故用于过滤细菌。然后将尿素溶液加入到已经灭菌的含有酚红的培养基中，备用。

（3）取适量含产脲酶细菌的10^-4、10^-5两种土壤稀释液，分别涂布接种到LB固体培养基和尿素固体培养基上，培养48h，推测固体培养基上生长的菌落数最少的是______（A. 10^-5稀释液+尿素固体培养基   B. 10^-5稀释液+LB固体培养基  C. 10^-4稀释液+尿素固体培养基  D. 10^-4稀释液+LB固体培养基）。在尿素固体培养基上产脲酶细菌菌落周围出现______，其原因是细菌产生的脲酶催化尿素分解产生______所致。

（4）制备固定化脲酶时，用石英砂吸附脲酶，装柱。再用蒸馏水洗涤固定化酶柱，其作用是_________。

（二）某小组欲进行烟草原生质体分离与培养的研究。请回答：

（1）原生质体的分离：在无菌条件下，取烟草无菌苗的叶片，放入含有0.5mol/L甘露醇（维持较高渗透压）的_________混合液处理，经过离心纯化后获得原生质体。

（2）原生质体的培养：将原生质体进行培养，重新长出细胞壁，形成胚性细胞。此时，应该_________培养基中甘露醇浓度，以利于胚性细胞继续培养形成细胞团，然后经两条途径形成再生植株。途径一：细胞团经球形胚、_________和胚状体，最后发育成植株。途径二：细胞团增殖为愈伤组织，然后在发芽培养基上诱导出芽，切割芽经过生根后形成完整植株。上述发芽培养基中含量相对较高的激素是_________，胚性细胞的主要特点是：_________。

（A．液泡小、细胞核小  B．液泡大，细胞核大  C．液泡大，细胞核小  D．液泡小、细胞核大）

（3）为了对烟草的某些性状进行改良，分离的到两种烟草的原生质体后，通过_________方法将他们的遗传物质组合在一起，经培养获得具有新性状的再生植株。提取再生植株的DNA，采用_________扩增相关基因，来鉴定遗传物质是否成功重组。

Answer

琼脂 高压蒸汽 孔径小，细菌不能滤过 A 红色环 氨（或NH3） 除去游离的脲酶 纤维素酶和果胶酶 降低 心形胚 细胞分裂素 D 原生质体融合 PCR

【解析】

本题主要考查培养基、酶固定化、植物组织培养等相关知识，要求考生熟记和掌握相关知识点的要点，能够在试题所给予的相对简单的情境中识别和使用它们。

（一）

（1）固体培养基常用琼脂作为凝固剂，LB固体培养基加入一定的蒸馏水后再加琼脂。

（2）对溶液、培养基等灭菌，常用的方法是高压蒸汽灭菌；用G6玻璃漏斗，因为G6玻璃砂漏斗孔径比细菌小，达到过滤除菌的目的。

（3）产生脲酶细菌菌落数目多，需稀释倍数较少，且使用含有尿素溶液的培养基，故选A；由于脲酶能催化尿素产生NH3，NH3易溶于水形成具有碱性的氨水，培养基中含酚红，使培养基变成红色环。

（4）在固定化酶过程中，有部分酶没有被固定在固相载体上，所以冲洗的目的是除去没有被固定的游离脲酶。

（二）

（1）制备烟草原生质体时需要除去细胞壁，植物细胞壁由纤维素和果胶组成，因此可以用纤维素酶和果胶酶除去植物细胞壁；
（2）原生质体的培养：将原生质体进行培养，重新长出细胞壁，形成胚性细胞的过程中，应该降低培养基中甘露醇浓度，以利用胚性细胞继续培养形成细胞团。胚性细胞继续培养形成细胞团，然后经两条途径形成再生植株，途径一：细胞团经球形胚、心形胚和胚状体，最后发育成植株。途径二：细胞团增殖为愈伤组织，然后在发芽培养基上诱导出芽，切割芽经过生根后形成完整植株。其过程中愈伤组织诱导产生芽的培养基中需要的细胞分裂素的比例较高，胚性细胞的主要特点是液泡小，细胞核大。
（3）为了对烟草的某些性状进行改良，分离的到两种烟草的原生质体后，通过原生质体融合的方法将他们的遗传物质组合在一起，经培养获得具有新性状的再生植株。提取再生植株的DNA，采用PCR技术扩增相关基因，来鉴定遗传物质是否成功重组。