Question

用基因工程技术从分离、提纯的圆褐固氮菌中获取固氮基因，然后进行PCR扩增。表1和表2分别表示用PCR扩增固氮基因的反应体系及反应条件。

表1

PCR反 应体系	缓冲液	脱氧核苷酸	引物A	引物B	DNA聚合酶	模板DNA
50 μL	5 μL	0.5 μL	0.5 μL	0.5 μL	0.5U	1～2 μL
加去离子水补足至50 μL

表2

反应 条件		复性	延伸	30次循环后	保温
温度	55 ℃	72 ℃	适宜	4 ℃
时间	30 s	1 min	5～10 min	2 h

(1)从表1和表2中可得出，PCR技术与DNA复制相比较，主要区别之一是__________。此外，从反应条件看，所使用的DNA聚合酶应具有____________________________________的特点。每次循环都需要2种引物的主要原因是______________________________________________。

(2)在对固氮基因产物的生产研究中，需要从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质。下图表示蛋白质提取和分离实验涉及的相关原理。    　

①图甲表示相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶色谱法分离的过程。试管中收集到的液体最先出现的是相对分子质量较大的蛋白质，原因是_________________________________________。

②图乙所示实验模拟电泳现象，U型管左侧的颜色逐渐变深，原因是_____________________。

Answer

需要ATP(或需要加入引物，或不需要解旋酶等) 耐高温 DNA聚合酶只能从3′端开始延伸DNA链 相对分子质量较大的蛋白质，从凝胶颗粒之间的间隙穿过凝胶柱，路程短，移动速度较快，最先洗脱出来 Fe(OH)3胶体带正电荷，在电场作用下，向阴极移动

【解析】

1、PCR技术的原理是模拟生物体内DNA分子复制的过程，利用DNA分子热变形原理，通过控制温度控制控制DNA分子的解聚和结合，DNA分子体内复制过程DNA的解旋是在解旋酶的作用下实现的；PCR扩增DNA片段过程最高经过n次扩增，形成的DNA分子数是2n个，其中只有2条单链不含有引物。

2、凝胶色谱法（分配色谱法）

（1）原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

（3）分离过程：

混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子。

洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

（4）作用：分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。

（1）从表1和表2中可得出，PCR技术与DNA复制相比较，主要区别之一是PCR技术不需要ATP（或需要加入引物，或不需要解旋酶等）。此外，从反应条件看，所使用的DNA聚合酶应具有耐高温的特点。每次循环都需要2种引物的主要原因是DNA聚合酶只能从3′端开始延伸DNA链。

（2）①相对分子质量较大的蛋白质，从凝胶颗粒之间的间隙穿过凝胶柱，路程短，移动速度较快，最先洗脱出来，因此试管中收集到的液体最先出现的是相对分子质量较大的蛋白质。
②图乙所示实验模拟电泳现象，U型管左侧的颜色逐渐变深，原因是Fe（OH）3胶体带正电荷，在电场作用下，向阴极移动。