Question

抗生素滥用导致的耐药性目前已成为一个严重的公共健康问题，近年来，“超级细菌”等事件的发生更显示出这一问题的严重性。抗菌肽（AMPs）是一类具有广谱抗菌性，而且其不易产生耐药性。为了改善抗菌肽的抗菌功能，常利用基因工程技术使抗菌肽在不同来源的宿主细胞内进行蛋白的重组表达。β-防御素是一种抗菌肽。构建β-防御素（β-defensin130）表达载体在大肠杆菌中表达。表达载体（PET-28a）和含有目的基因β-防御素（defensin130）的片段如下，结合已知条件回答下列问题：

（说明：Kan^r和Amp^r分别表示卡那霉素和氨苄青霉素抗性基因；promoter表示基因的启动部位）

（1）获得含有目的基因的重组DNA分子，需用___________和___________两种酶分别切割表达载体和含有目的基因的片段，并用___________酶将它们连接。

（2）把构建好的重组DNA分子导入到受体细胞，用适宜浓度的氯化钙处理受体细胞增加细胞壁的通透性的目的是___________。

（3）筛选含有目的基因β-防御素（β-defensin130）的受体细胞，先将菌液涂布在含有___________（抗生素）的培养基中培养，然后将所有菌落转移至含有___________（抗生素）的培养基中培养，最后挑选出目的菌落。

（4）在无菌操作下将目的单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37°C培养24小时后，置于___________冰箱中保存。

（5）若受体细胞为双子叶植物，常用___________法将目的基因导入植物体细胞，再将体细胞进行组织培养，得到转基因植物。

Answer

EcoRI XhoI DNA连接酶 增加转化的成功率 Kan Amp 4°C 农杆菌转化

【解析】

基因工程的步骤包括：提取目的基因、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。菌种保藏包括临时保藏和长期保存。临时保藏是将菌种接种在固体斜面培养基上，在合适的温度下培养，当菌落长成后，将试管置于4°C冰箱中保存。

（1）根据图示中目的基因两端限制酶的酶切位点以及质粒上限制酶的酶切位点可知获得含有目的基因的重组DNA分子，需用EcoRI和XhoI两种酶分别切割表达载体和含有目的基因的片段，以保证载体和目的基因能形成相同的黏性末端，并用DNA连接酶将它们连接。

（2）把构建好的重组DNA分子导入到受体细胞，用适宜浓度的氯化钙处理受体细胞增加细胞壁的通透性，目的是使受体细胞成为感受态，使表达载体容易进入受体细胞，以增加转化的成功率。

（3）筛选含有目的基因β-防御素（β-defensin130）的受体细胞，先将菌液涂布在含有Kan的培养基中培养，然后将所有菌落转移至含有Amp的培养基中培养，最后挑选出目的菌落。

（4）菌种的临时保藏需在无菌操作下将目的单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37°C培养24小时后，置于4°C冰箱中保存。

（5）农杆菌在自然条件下可感染双子叶植物和裸子植物，所以若受体细胞为双子叶植物，常用农杆菌转化法将目的基因导入植物体细胞，再将体细胞进行组织培养，得到转基因植物。