Question

栾树适合生长于石灰石风化产生的钙基土壤中，抗恶劣环境的能力强，因此常用于矿区废弃地恢复过程中的种植。为了增加栾树的耐旱性，某科研所将耐旱基因导入栾树中，流程图如图所示，回答下列问题：

限制酶	BamHI	HindⅢ	EcoRI
识别序列及切割位点	G↓GATCC CCTAG↑G	A↓AGCTT TTCGA↑A	G↓AATTC CTTAA↑G

（1）构建重组质粒的过程中，为了避免目的基因和载体切割后产生的末端发生任意链接，应选择限制酶_______________分别切割载体和含目的基因的DNA片段，完全酶切后产生的DNA片段分别为_____________，经DNA连接酶连接后，可以得到___________种重组质粒。

（2）如果将耐旱基因直接导入栾树细胞，一般情况下，栾树不会具有耐旱特性，原因是耐旱基因在栾树细胞中不能___________，也不能___________。

（3）耐盐基因应插入到农杆菌________________上，通过转化作用进入栾树细胞并整合到________，这是__________________________________的关键。

（4）要获得大量该耐盐基因，可利用PCR技术进行扩增，图2为引物对与模板结合示意图，扩增的第5次，需要_________个引物。表1为根据模板设计的两对引物序列，请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？________。

引物对 A	P AACTGAAATGTAGCTATC P TTAAGTCCATTACTCTAG
引物对 B	S GTCCGACTAGTGGCTGTG S AGCTGGCGTTTAGCCTCG

 

Answer

BamHⅠ和HindⅢ 3和4 2 稳定存在（复制） 表达 Ti质粒的T-DNA上 染色体DNA上 目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键 32 引物对B

【解析】

分析题图：含目的基因的DNA和质粒上均有HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位点，但EcoRⅠ酶切位点位于目的基因上，切割会破坏目的基因，BamHⅠ酶切割质粒自身环化，用BamHI 和HindⅢ酶对外源DNA和质粒进行切割。

（1）由分析可知，为了避免目的基因和载体切割后产生的末端发生任意链接，需要使用 HindⅢ和BamHⅠ在Ti质粒上进行切割。质粒上有2个HindⅢ的酶切位点，有1个BamHⅠ的酶切位点，完全酶切后质粒上的DNA片段为3；目的基因上有一个HindⅢ和两个BamHⅠ的酶切位点，完全切割后产生的DNA片段为4。使用使用 HindⅢ和BamHⅠ酶切后，目的基因有2个片段均可以与质粒连接，因此经DNA连接酶连接后，可以得到2种重组质粒。

（2）如果将耐旱基因直接导入栾树细胞，一般情况下，培育出的栾树植株不具有耐旱特性，原因是耐旱基因在栾树细胞中不能复制和表达，所以需要构建基因表达载体。

（3）耐旱基因应插入到农杆菌Ti质粒的T—DNA上，通过转化作用进入栾树细胞并整合到染色体DNA上，使耐旱基因能稳定维持并发挥作用，这也是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键。

（4）扩增4次，含有16个DNA分子，DNA为双链，则扩增第5次需要32个引物。退火温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定，引物对B中G/C碱基含量较高，可采用较高的退火温度。