Question

人体内的t-PA蛋白能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的t-PA会诱发颅内出血，其原因在丁t-PA作用的特异性不高。研究证实，将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。

(1)依据所需t-PA蛋白的结构和功能，对天然的t-PA基因进行序列改造，可制造出性能优异的t-PA突变蛋白，该技术称为_______________。

(2)已知人t-PA基因第84位半胱氨酸的模板链序列为ACA，而丝氨酸的密码子为UCU，因此突变基因编码该氨基酸的模板链序列应设计为______________。

(3)若获得的t-PA突变基因如下图所示，那么质粒pCLY11需用_______________两种限制酶切开，才能与t-PA突变基因高效连接。

(4)将连接成功的基因表达载休导入大肠杆菌中，在含有___________的培养基上挑选颜色呈____________的菌落，初步筛选导入成功的细胞。

(5)检测t-PA突变基因是否导入大肠杆菌，可利用t-PA突变基因制备探针，进行_______________，检测是否有杂交链；也可依据t-PA突变基因两端的序列设计引物对大肠杆菌的DNA进行PCR扩增，若出现了_______________说明t-PA突变基因已经导入了受体细胞。

(6)在上述步骤成功的基础上，若没有能从大肠杆菌中提取到相应的t-PA突变蛋白，其可能的原因是________________。

Answer

蛋白质工程 AGA XmaⅠ和BglⅡ 新霉素 白色 DNA分子杂交 扩增产物（子代DNA） 目的基因的转录或翻译异常

【解析】

1、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）

2、蛋白质工程的基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）以上是蛋白质工程特有的途径；以下按照基因工程的一般步骤进行。（注意：目的基因只能用人工合成的方法）

（1）通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求，该技术成为蛋白质工程。

（2）因为制造性能优异的t-PA突变蛋白，是将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，已知人t-PA基因第84位半胱氨酸的编码序列（即模板链的互补链序列）为ACA，而丝氨酸的密码子为UCU，因此突变基因编码该氨基酸的编码序列应设计为AGA。

（3）由于目的基因的两端的碱基序列分别是CCGG、CTAG，所以应用XmaI和BglII两种限制酶切割，以便于把目的基因连接到质粒pCLY11上。

（4）由图1可知，将连接好的DNA分子导入大肠杆菌中，由于限制酶切割质粒破坏了mlacZ基因，所以含t-PA突变基因重组DNA分子的细胞应具有的表型是新霉素抗性且呈白色，所以可以在含新霉素的培养基上挑选白色的菌落。

（5）检测目的基因是否倒入受体细胞可以用t-PA突变基因制备探针，进行DNA分子杂交；也可以依据t-PA突变基因两端的序列设计引物对大肠杆菌的DNA进行PCR扩增，如果出现子代DNA分子，说明已经倒入受体细胞。

（6）如果已经检测到基因，但没有相关的蛋白质，蛋白质的合成需要经过转录和翻译，所以可能原因是目的基因没有转录和翻译。