Question

阅读下面的材料，完成（1）～（5）题。

科研人员建立了一种新的靶向基因敲除技术——TALEN技术（原理见下图）。TALEN技术使用的基因敲除工具是由DNA识别域和核酸内切酶两个部分组成的蛋白质。科学家发现了一种细菌蛋白质（TALE），它的二连氨基酸（NI、NG、HD、NN，其中字母N、I、G、H、D分别代表了一种氨基酸）与四种碱基（A、G、C、T）有恒定的对应关系：NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G。FokⅠ是一种形成二聚体后具有核酸内切酶活性的蛋白单体。因此，可以利用TALE作为DNA识别域，用FokⅠ二聚体定点切断DNA。

科学家发现水稻植株无论是否具有光周期敏感蛋白基因P，在短日照条件下均表现为雄性可育。在长日照条件下，具有光周期敏感蛋白的水稻才能雄性可育。基因P只在单倍体花粉细胞中表达，使其能够合成淀粉。科研人员使用TALEN技术对水稻基因P进行靶向敲除，以得到光敏雄性不育水稻新品种。

（1）在TALEN技术的设计中，选择使用FokⅠ单体而不直接使用FokⅠ二聚体，这样能减少对DNA的__________切割，保证了基因敲除的靶向性。为了让TALEN技术能用于各种不同生物、不同基因的敲除，没有与TALE蛋白结合的FokⅠ二聚体对DNA的切割应__________（选填“具有”或“不具有”）类似于限制酶的“限制性”。

（2）若TALE蛋白左臂所识别的基因P的序列为“-TGACC-” ，则TALE蛋白左臂对应的二连氨基酸序列应为__________。用这种方法，可以确定TALE蛋白的氨基酸序列，进而人工合成TALE蛋白基因。然后将TALE蛋白基因与__________基因进行融合，得到融合基因。

（3）科研人员用图2所示的质粒为载体，其中的潮霉素抗性作为标记基因，作用是__________。应选用__________酶将该质粒与融合基因构建为重组质粒，并将融合基因设法导入到水稻愈伤组织中，再利用__________技术获得T₀代植株。

（4）由于基因靶向敲除成功的概率比较低，所以科研人员培育T₀代植株时应保证__________日照条件，待其自花受粉得到T₁代，再将T₁代植株__________，并在开花期随机选择一部分植株的花粉进行鉴定，鉴定方法是__________。若观察到某植株的花粉全部未被染成蓝色，则该植株为所需的纯合光敏雄性不育新品种。

（5）与传统的雄性不育水稻品种相比，光敏雄性不育新品种的优势在于它能实现自交繁殖并保留雄性不育特性，这是因为__________。

Answer

非靶向（或“随机”） 不具有 FokⅠ单体 筛选转化成功的受体细胞 BamH Ⅰ及DNA连接 植物组织培养 短 在长日照下种植 将花粉用碘液染色后，在显微镜下观察 光敏雄性不育新品种在短日照条件下雄性可育，可实现自交繁殖；自交后代能保持基因P敲除的纯合性，使其在长日照条件下雄性不育

【解析】

分析题干的信息：细菌蛋白质（TALE）与四种碱基（A、G、C、T）有恒定的对应关系，FokⅠ是一种形成二聚体后具有核酸内切酶活性的蛋白单体。

水稻植株无论是否具有光周期敏感蛋白基因P，在短日照条件下均表现为雄性可育。在长日照条件下，具有光周期敏感蛋白的水稻才能雄性可育。

基因P只在单倍体花粉细胞中表达，使其能够合成淀粉。

（1）如果使用FokⅠ二聚体，根据图示，可以对靶基因的左侧和右侧序列进行随机切割，所以为了较少对DNA的随机（非靶向）切割，保证了基因敲除的靶向性。由于限制酶的特点是识别特定的序列并在特定的位点进行切割，所以应选择不具有类似于限制酶的“限制性”。

（2）根据NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G，所以二连氨基酸序列应为，融合基因可以将TALE蛋白基因和FokⅠ单体基因进行融合，如果表达后就可以获得具有特异性识别并且切割的酶。

（3）在基因工程中，标记基因的作用是筛选转化成功的受体细胞，根据启动子的启动方向可知，用HindⅢ酶处理，目的基因插入的位置是表达不出来的，所以选择BamHⅠ进行切割，并用同种酶处理目的基因，再用DNA连接酶形成重组质粒，将融合基因设法导入到水稻愈伤组织中后，在利用植物组织培养技术获得T0代植株。

（4）由于在短日照条件下均表现为雄性可育，在长日照条件下，具有光周期敏感蛋白的水稻才能雄性可育，所以T0代应该保证短日照条件，获得F1代后将其放入长日照下种植，淘汰没有光周期蛋白的个体，然后进行花粉鉴定，因为基因P只在单倍体花粉细胞中表达，使其能够合成淀粉，所以可以用碘液染色。

（5）由于光敏雄性不育新品种在短日照条件下雄性可育，可实现自交繁殖；自交后代能保持基因P敲除的纯合性，使其在长日照条件下雄性不育，所以与传统的雄性不育水稻品种相比，光敏雄性不育新品种的优势在于它能实现自交繁殖并保留雄性不育特性。