Question

图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：

（1）若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，其产物长度为_________________。

（2）若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从隐性纯合子分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有_________种不同DNA片段。为了提高实验成功率，需要通过___________技术扩增目的基因，以获得目的基因的大量拷贝，该技术原理为__________________。

（3）若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是__________。在导入重组质粒后，为了筛选出含质粒的大肠杆菌，一般需要用添加________的培养基进行培养，想进一步筛选出含重组质粒的受体细胞，还需要接种到含_____________的培养基中培养。

（4）假设用BamHⅠ切割DNA获取目的基因，用MboⅠ切割质粒，然后形成重组质粒，若将插入在抗生素B抗性基因处的目的基因重新切割下来，能否再次用BamHⅠ_________（填：可以、不可以、不一定），原因是：________________________________________。

Answer

.537bp、790bp、661bp 2 PCR DNA双链复制 BamHI 抗生素B 抗生素A 不一定 因为目的基因和抗生素B抗性基因拼接处不一定出现GGATCC

【解析】

分析图1：图1基因片段中含有2个限制酶SmaⅠ（识别序列CCC↓GGG）的切割位点，因此用SmaⅠ切割可得到三种长度的DNA片段。
分析图2：图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列，其中有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ3种限制性核酸内切酶的识别序列和切割位点，分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。

（1）SmaⅠ的识别序列和酶切位点是CCC↓GGG，可知其切割产生的末端是平末端，产物长度是534+3=537bp、796-3-3=790bp、658+3=661bp。
（2）基因D会被SmaⅠ切割形成三个片段（长度分别为537bp、790bp、661bp）；若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，则基因D就突变为基因d，且基因d只有一个SmaⅠ的酶切位点，因而基因d会被SmaⅠ切割形成两个片段（长度分别为1327bp、661bp）。为了提高实验成功率，可以通过PCR技术大量扩增目的基因，以获得目的基因的大量拷贝，该技术模拟了体内DNA复制的过程，原理为DNA双链复制。
（3）由图可知，目的基因D两侧都是限制酶BamH I的识别序列，因此应选用限制酶BamH I切割图1中含有目的基因D的外源DNA分子和图2中的质粒。用BamH I切割质粒后会破坏抗生素A抗性基因，但不会破坏抗生素B抗性基因，因此一般需要用添加抗生素B的培养基进行培养；若想进一步筛选出含重组质粒的受体细胞，还需要接种到含抗生素A的培养基中培养筛选出含有重组质粒的大肠杆菌。
（4）假设用BamHⅠ切割DNA获取目的基因，用MboⅠ切割质粒，然后形成重组质粒，若将插入在抗生素B抗性基因处的目的基因重新切割下来，再次用BamHⅠ不一定能将其切割，因为目的基因和抗生素B抗性基因的粘性末端随意连接，拼接处不一定出现GGATCC。