Question

变异链球菌在牙面的粘附、集聚是龋齿发生的先决条件。转基因防龋疫苗是通过基因工程技术，将变异链球菌中与龋齿发生密切相关的抗原基因（PAcA基因）转入植物的表达载体中，利用植物生物反应器生产的基因工程疫苗。请回答下列相关问题：

(1)转基因植物的制备

单一使用PAcA基因，机体免疫应答不理想，霍乱毒素中有增强机体免疫应答的氨基酸序列（CTB)，将CTB基因与PAcA基因连接成嵌合（PAcA-CTB)基因，作为________与Ti质粒的T-DNA拼接，构建表达载体，此过程需要的酶是________。用_______法导入离体的黄瓜叶肉细胞中，经植物组织培养获得转基因植株。相关基因能否在黄瓜细胞中稳定遗传的关键是________。此基因疫苗起抗原作用的是_______(基因/蛋白质）。

(2)转基因植株目的基因的PCR鉴定与检测 已知PAcA-CTB基因部分序列如下（左侧为基因的首端）：

5'…CCGTGT……ATGCCT---3’

3'…GGCACA……TACGGA---5’

根据上述序列选择引物________(填字母）进行PCR。

A.引物：5'-GGCACA-3'    B.引物：5，-AGGCAT-3'

C.引物：5'-CCGUGU-3'    D.引物：5，-CCGTGT-3'

反应结束后，电泳检测PCR产物，结果如下图（1来自未转化植株，2是含PAcA-CTB基因的质粒，3-8来自转基因植物)，从结果可以看出，________________号植物含有PAcA-CTB基因。若获得的转基因植物并没有产生相应的基因工程疫苗，根据中心法则分析，其可能的原因是_______。

Answer

目的基因 限制性核酸内切酶和DNA连接酶 农杆菌转化 相关基因是否整合到黄瓜的DNA分子上 蛋白质 BD 3、5、8 目的基因（PAcA-CTB）没有转录或转录的mRNA没有翻译

【解析】

基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样.将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：

分子水平上的检测：

①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；

②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；

③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。

个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

(1)转基因植物的制备：单一使用PAcA基因，机体免疫应答不理想，霍乱毒素中有增强机体免疫应答的氨基酸序列（CTB)，将CTB基因与PAcA基因连接成嵌合（PAcA-CTB)基因，作为抗原目的基因与Ti质粒的T-DNA拼接，构建表达载体，此过程需要的酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶。用农杆菌转化法导入离体的黄瓜叶肉细胞中，经植物组织培养获得转基因植株。相关基因能否在黄瓜细胞中稳定遗传的关键是相关基因是否整合到黄瓜的DNA分子上。此基因疫苗起抗原作用的是基因的表达产物蛋白质。

(2)已知PAcA-CTB基因部分序列如下（左侧为基因的首端）：

5'…CCGTGT……ATGCCT---3’

3'…GGCACA……TACGGA---5’

由于PCR技术中，子链合成方向是从5到3’，因此应该选择引物BD进行PCR。反应结束后，电泳检测PCR产物，结果如下图（1来自未转化植株，2是含PAcA-CTB基因的质粒，3-8来自转基因植物)，从结果可以看出，3、5、8号植物含有PAcA-CTB基因。若获得的转基因植物并没有产生相应的基因工程疫苗，可能的原因是目的基因（PAcA-CTB）没有转录或转录的mRNA没有翻译。