Question

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种动物传染病，目前常用接种弱毒疫苗的方法预防。疫苗的主要成分是该病毒的一种结构蛋白VP1。科学家尝试利用转基因番茄来生产口蹄疫疫苗。请回答下列问题。

（1）上图是VP1基因、农杆菌Ti质粒结构示意图，若用以构建具有VP1基因的基因表达载体，还需要在质粒中插入__________________。

（2）口蹄疫病毒的遗传物质为RNA，则获得可重组到质粒的VP1基因必须用到____________酶。要获得大量VP1基因，可利用__________技术进行扩增。 

（3）通常用BamHⅠ、HindⅢ两种限制酶切割VP1基因和Ti质粒的目的是____________________。要筛选出含有该目的基因表达载体的农杆菌，首先需要在含________________的培养基上进行。

（4）VP1基因应插入到农杆菌Ti质粒的T-DNA上，通过转化作用进入番茄细胞并插入到______________，使VP1基因能够稳定存在并发挥作用。

（5）获得表达VP1蛋白的番茄植株以后，要进行免疫效力的测定，具体方法是将从转基因番茄叶片中提取的VP1蛋白质注射到一定数量的豚鼠体内，每半个月注射一次，三次注射后检测豚鼠血液中产生的___________________数量，为了使结果可信，应设置空白对照组。

Answer

启动子 逆转录 PCR 防止VP1基因、Ti质粒的自身环化和反向连接 卡那霉素 染色体DNA VP1蛋白的抗体

【解析】

基因表达载体的构建过程中，目的基因、启动子、终止子和标记基因不可缺少，其中标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，据题意可知，目的基因是VP1基因。

（1）上图是VP1基因、农杆菌Ti质粒结构示意图，已经具备复制原点、终止子、标记基因、目的基因等，因此还需要在质粒中插入启动子。

（2）口蹄疫病毒的遗传物质为RNA，因此要获得可重组到质粒的VP1基因，必须先逆转录生成相应的DNA，需用到逆转录酶。要获得大量VP1基因，可利用PCR技术进行扩增。

（3）如果只用同一种限制酶切割，产生的黏性末端相同，会出现目的基因、运载体自身环化，或者目的基因和运载体反向连接，因此用BamHⅠ、HindⅢ两种限制酶切割VP1基因和Ti质粒，可以防止VP1基因、Ti质粒的自身环化和反向连接。由于普通农杆菌中不含标记基因，只有导入重组质粒的农杆菌中含卡那霉素抗性基因，所以在培养基中添加卡那霉素可筛选出含有该目的基因表达载体的农杆菌。

（4）VP1基因应插入到农杆菌Ti质粒的T-DNA上，通过转化作用进入番茄细胞并插入到染色体DNA上，使VP1基因能够稳定存在并发挥作用。

（5）VP1蛋白质作为抗原注射到小鼠体内，可引起小鼠产生特异性免疫反应，产生相应的抗体，其结果可通过检测豚鼠血液中产生的VP1蛋白的抗体数量来确定；为了使结果可信，应设置注射生理盐水的空白对照组。