Question

WWP2基因在肿瘤细胞中高度表达，WWP2蛋白参与肿瘤细胞的生长、存活和转移等。为获得较多WWP2蛋白，利用基因工程技术设计引物，其中正向引物5′含有 EcoRI酶切位点，反向引物5′含有XhoI酶切位点。将WWP2基因与相应载体构建重组质粒导入人胚肾细胞。回答下列问题：

(1)利用上述的引物，以肺癌细胞的cDNA为模板，通过___________扩增___________的编码序列，获得需要的目的基因片段。

(2)把获得的目的基因片段和相应载体，都用___________进行酶切，分别在5′端与3′端形成___________，避免自身环化。然后利用___________将目的基因片段和相应载体连接，得到重组质粒。

(3)先将重组质粒导入经___________处理过的大肠杆菌细胞，培养后从中分离得到较多的重组质粒。

(4)培养人胚肾细胞时，先用___________使人胚肾细胞分散成单个细胞，用含有___________的合成培养液培养，并将培养瓶置于体积分数为5%的___________与空气混合气体的培养箱中培养。

(5)将重组质粒导入人胚肾细胞中，48小时后提取蛋白质并检测到WWP2蛋白，说明___________。

(6)致癌因子会损伤肺泡细胞中的___________，使原癌基因和抑癌基因发生突变。研究WWP2蛋白的表达，为肺癌治疗新靶点奠定了基础。

Answer

PCR技术 WWP2基因 EcoRI酶和 Xhol酶 不同的黏性末端 DNA连接酶 Ca2+ 胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理 动物血清（血浆） CO2 （重组质粒中的）目的基因（或WWP2基因）在人胚肾细胞中能够正常表达 DNA分子

【解析】

基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）获取目的基因可以采用PCR扩增技术，PCR扩增过程中需要引物与模板结合，因此以肺癌细胞的cDNA为模板与题干中的因为结合，然后扩增WWP2基因，获得需要的目的基因片段。

（2）根据题意，目的基因的两端分别有EcoRI酶切位点和XhoI酶切位点，故同时用EcoRI酶和 Xhol酶对目的基因片段和相应载体进行酶切，分别在5′端与3′端形成不同的黏性末端，可以避免自身环化。然后利用DNA连接酶将目的基因片段和相应载体连接，得到重组质粒。

（3）大肠杆菌细胞需要用一定浓度的Ca2+溶液处理，使之处于感受态易于吸收重组质粒，重组质粒导入大肠杆菌后经过培养进行增殖，以便获得较多的重组质粒。

（4）进行人胚肾细胞培养时，先用胰蛋白酶或者胶原蛋白酶进行处理，使之分散成单个细胞，动物细胞培养过程中一般需要在合成培养基中添加动物血清或血浆，培养过程中需要的气体环境是5%二氧化碳和95%的空气混合培养，二氧化碳的作用是维持培养液的pH值。

（5）将重组质粒导入人胚肾细胞中，48小时后提取蛋白质并检测到WWP2蛋白，说明目的基因在人胚肾细胞中得到表达，合成了相应的蛋白质。

（6）细胞癌变的原因是由于致癌因子的作用，使得细胞内的DNA分子损伤，导致原癌基因和抑癌基因发生突变引起的。