Question

斑马鱼的酶 D 由 17 号染色体上的 D 基因编码。利用转基因技术将绿色荧光蛋白基因（G）整合到斑马鱼 17 号染色体上，带有 G 基因的胚胎能够发出绿色荧光。具有纯合突变基因（dd）的斑马鱼胚胎会发出红色荧光。未整合 G 基因的染色体的对应位点表示为 g。图 1 和图 2 所示分别为实验所用的质粒上相关酶切位点以及含绿色荧光蛋白基因（G）的外源 DNA 片段上具有的相关酶切位点。据图回答下列问题：

（1）将绿色荧光蛋白（G）基因整合到斑马鱼 17 号染色体上的实验过程中，首先要将G 基因与质粒重组，此过程需要的两种工具酶是限制酶和_________。

（2）经筛选获得的重组质粒需要经显微注射到斑马鱼的_________细胞中加以培养、筛选。如果培养得到的胚胎能_________，说明 G 基因已经成功整合到染色体上并且该基因已经得以表达。

（3）用图 1 中质粒和图 2 外源 DNA 构建重组质粒，不能使用________切割，原因是 _______。如果要防止质粒和含目的基因的外源 DNA 片段自身环化，则应选择下列方法 ________为好。

①只使用 EcoR I 处理    ②使用 BamH I 和 SmaⅠ同时处理

③使用 BamH I 和 HindⅢ    ④使用 Sma I 和 HindⅢ同时处理

（4）现用转基因个体 N 和个体 M 进行如下杂交实验得到的子代胚胎表现型如图 3 所示，推测亲代 M 的基因型是_________。

（5）子代中只发出绿色荧光的胚胎基因型包括_________。

①DDGG    ②DDGg    ③DdGg    ④DdGG

Answer

DNA 连接酶 受精卵（早期胚胎） 发出绿色荧光 SmaⅠ 会破坏质粒的抗性基因和的目的基因 ③ Ddgg ②、③

【解析】

分析图1和图2：质粒和含有目的基因的外源DNA分子中都含有4种限制酶的切割位点，但其中限制酶SmaⅠ的切割位点位于目的基因和质粒的抗性基因上，用其切割会破坏目的基因和抗性基因。

分析图3：M（D_gg）×N（DdGg）→绿色荧光（D_G_）、红色荧光（ddgg）、无荧光（Ddgg）、红•绿荧光（Ggdd），说明N的基因型为Ddgg。

（1）将G基因与质粒重组的过程中，首先需要限制酶切割含有目的基因的DNA片段和运载体，其次需用DNA连接酶将目的基因G和质粒连接形成重组质粒。

（2）受精卵细胞的全能性高，因此需将筛选获得的重组质粒经显微注射到斑马鱼的受精卵细胞中加以培养、筛选。若G基因已经成功整合到染色体上并且该基因已经得以表达，则培养得到的胚胎能发出绿色荧光。

（3）由于目的基因和质粒的抗性基因上都含有限制酶SmaⅠ的切割位点，用SmaⅠ切割会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因，因此用图1中的质粒和图2外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割。用限制酶BamH I和HindⅢ同时处理，既可防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，也可以防止目的基因和质粒反向连接。

（4）由图可知，D和d基因、G和g基因都位于同源染色体上，它们表现为连锁遗传。现用转基因个体N（DdGg）和个体M（胚胎期无荧光，基因型为D_gg）进行杂交实验，得到子代胚胎中有绿色荧光（D_G_）、红色荧光（ddgg）、无荧光（Ddgg）、红•绿荧光（Ggdd），由此可推测亲代M的基因型为Ddgg。

（5）亲本的基因型为Ddgg×DdGg，且两对等位基因位于一对同源染色体上，表现为连锁遗传，因此子代中只发出绿色荧光的胚胎（D_G_）的基因型包括②DDGg（M的DG与N的Dg组合形成）、③DdGg（M的DG与N的dg组合形成、M的17号染色体交换形成的dG与N的Dg组合形成）。