Question

图1是科研工作者利用差异杂交法获取相关目的基因的研究；图2是克隆出的花色基因C，和实验所用质粒表达载体简图（箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoRI、BamlI的酶切位点，amp^R为青霉素抗性基因，tet^R为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点），拟将其与质粒重组，再借助农杆菌导入菊花中。请据图回答问题：

(1)图1中，A过程需要用____________酶，D过程需要筛选____________（填“未杂交”或“杂交分子”）的含³²P的cDNA单链，继而通过人工合成，获得双链cDNA，并用其构建基因文库。

(2)图2中菊花组织培养的培养基常用_________方法灭菌。菊花的组织培养过程③需添加生长素和细胞分裂素，当其比值_________（升高/降低/适中）促进生根。

(3)图3表示运用影印培养法（使一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法）检测基因表达载体是否导入了农杆菌。培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A和培养基B分别还含有__________、__________。从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是___________（填数字）菌落中的细菌。

(4)为确定基因C是否整合到菊花染色体的DNA上，可用放射性同位素标记的___________作为探针进行分子检测，还需要在个体水平上通过_________鉴定。

(5)本实验中，对质粒进行酶切时，只能单一酶切，不能双酶切，原因是____________。为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。下图所示为6条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是______________可以扩增出了450bp片段。若目的基因反向连接了，那么选图中引物__________，可从某一菌落的质粒中扩增出了500bp片段。

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Answer

逆转录 未杂交 高压蒸汽灭菌 升高 青霉素（ampR） 四环素（tetR）（或ampR和tetR） 4和6 基因C 观察花色 基因c只有EcoRI的酶切位点，当质粒被同一种酶切割后产生同样的末端基因C才能和质粒连接成环状（只答基因C只有EcoRI的酶切位点即可） db bc

【解析】

基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因：DNA-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA：DNA-RNA分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

分析图2：图示为转基因抗盐烟草的培育过程，首先构建基因表达载体；其次采用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞（烟草细胞）；再采用植物组织培养技术将含有目的基因的烟草细胞培养成转基因抗盐烟草。

分析图3：图2是筛选含有重组质粒的农杆菌的过程，培养基A和B中应该分别加入氨苄青霉素、四环素。

（1）据图可知图1为构建基因文库的过程，其中需要单链mRNA通过A过程形成杂交双链分子，需要逆转录酶，D过程需要回收未杂交的含32P的cDNA单链，继而通过人工合成，获得双链cDNA，并用其构建基因文库。

（2）培养基通过采用高压蒸汽灭菌法处理。菊花的组织培养过程③需添加生长素和细胞分裂素，当生长素比值增大时有利于生根。

（3）用EcoRI、BamlI两种限制酶对质粒进行切割时，会破会四环素抗性基因，但不会破坏氨苄青霉素抗性基因，因此导入重组质粒的农杆菌能在含有氨苄青霉素的培养基上能生存，但不能在含有四环素培养基上生存，所以培养基A和培养基B分别还含有氨苄青霉素、四环素，含目的基因的是4和6菌落中的细菌。

（4）为确定基因C是否整合到菊花染色体的DNA上，可用放射性同位素标记的基因C为探针进行分子检测，由于基因C控制花色的形成，因此还需要在个体水平上通过观察花色进行鉴定。

（5）据图分析，根据目的基因插入的位置和PCR技术的原理分析，PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，沿着相反的方向合成子链，因此要扩增出450bp片段，PCR鉴定时应该选择的一对引物是db；根据题意和图形分析，若目的基因发生了反向连接，用图中的另外一对引物bc从某一菌落的质粒中可以扩增出500bp的片段。