Question

如图是将某抗原基因导入大肠杆菌内制备“工程菌”的示意图，图中BamHI、EcoRI、SmaI、HindⅢ分别代表相应的限制酶。回答下列问题：

（1）获得抗原基因的途径可以是以抗原蛋白的mRNA为模板，在______酶的催化下，获得所需基因。

（2）利用质粒作为运载体时，常常需要对天然质粒进行改造，若图中P为启动子，它是_____的位点；青霉素抗性基因和四环素抗性基因可作为____基因，其作用是_____。

（3）利用PCR技术扩增抗原基因时，需要在反应体系中添加的物质有_____、成对的_______、4种dNTP和热稳定性DNA聚合酶等，扩增过程可以在PCR扩增仪中完成。

（4）构建重组质粒时，一般使用BamH I和HindⅢ对含抗原基因的DNA片段和质粒分别进行切割，而不单独使用EcoR I切割，是由于BamH I和HindⅢ共同切割可以防止_____。筛选该工程菌时应进行两次筛选，先在添加____的培养基中选出导入质粒的大肠杆菌单菌落，将单菌落分别接种到液体培养基中，培养一段时间后，取菌液在添加_____的平板上划线，将导入重组质粒的工程菌筛选出来。

Answer

反转录 RNA聚合酶识别和结合 标记 便于鉴别和筛选出含有目的基因的受体细胞 抗原基因 引物 质粒和目的基因自身环化，同时也可防止目的基因与质粒反向连接 青霉素 四环素

【解析】

分析质粒：质粒上含有BamHI、EcoRI、HindⅢ的切割位点，其中HindⅢ限制酶的切割位点位于四环素抗性基因上。

分析图抗原基因：质粒上有限制酶EcoRI、BamHⅠ、SmaI 、HindIII四种限制酶的识别序列和切割位点，其中SmaI的切割位点位于抗原基因上。

（1）获得抗原基因有两条途径：一是以抗原基因的mRNA为模板，在逆转录酶的催化下，反转录合成双链DNA，从而获得所需基因；二是根据目标蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其DNA的脱氧核苷酸序列，再通过人工合成（化学）方法合成所需基因。

（2）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。可以驱动目的基因的转录形成mRNA。青霉素抗性基因和四环素抗性基因是做标记基因。标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因（以便筛选出含有目的基因的细胞）。

（3）PCR是一种在生物体外复制特定DNA片断的核酸合成技术，它是利用DNA双连复制的原理。利用PCR技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有：模板DNA（抗原基因）、热稳定性DNA聚合酶、引物和4种脱氧核糖核苷三磷酸。因为DNA复制时，子链总是从5′向 3′方向延伸，而子链与模板链反向平行。

（4）构建含抗原基因的重组质粒时，用SmaⅠ切割会破抗原基因，不能使用SmaⅠ切割。由于抗原基因和质粒性基因上都含有限制酶BamHI、EcoRI、HindⅢ的切割位点，如果单独用限制酶EcoRI 切割，会形成相同的黏性末端，导致质粒和抗原基因自身的环化。用BamHI和HindⅢ同时处理，这样使目的基因两端的黏性末端不同，既可防止质粒和含抗原基因的外源DNA片段自身环化，也可以防止抗原基因和质粒反向连接，同理，也可以防止质粒自身环化。分析图形可知，HindⅢ酶切割会导致四环素抗性基因破坏，因此为了筛选出含转入抗原基因的重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加青霉素，平板上长出的菌落，需要进一步鉴定才能筛选出含有目的基因的大肠杆菌的单菌落，这是由于平板上长出的菌落有的含有质粒，有的含有重组质粒。需再一次筛选，需取菌液在添加四环素的平板上划线，将导入重组质粒的工程菌筛选出来。