Question

科学家将鱼抗冻蛋白基因转入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，可以在相对寒冷的环境中生长。质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、AluⅠ等四种限制酶切割位点，下图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图（ampr为抗氨苄青霉素基因），其中①～④是转基因抗冻番茄培育过程中的相关步骤，Ⅰ、Ⅱ表示相关结构或细胞。请据图作答：

（1）在构建基因表达载体时，可用一种或者多种限制酶进行切割。为了避免目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，在此实例中，应该选用限制酶_____分别对______进行切割，切割后产生的DNA片段分别为__________种、_______________种。

（2）培养基中的氨苄青霉素会抑制番茄愈伤组织细胞的生长，要利用该培养基筛选已导入含鱼的抗冻蛋白基因的番茄细胞，应使基因表达载体Ⅰ中含有_______________作为标记基因。

（3）研究人员通常采用_______________法将鱼抗冻蛋白基因导入番茄细胞内。通常采用_______________技术，在分子水平检测目的基因是否翻译形成了相应的蛋白质。

（4）利用组织培养技术将导入含鱼的抗冻蛋白基因的番茄组织细胞培育成植株。图中③、④依次表示组织培养过程中番茄组织细胞的_______________过程。

Answer

PstⅠ、SmaⅠ 含鱼抗冻蛋白基因的DNA、质粒 4 2 抗氨苄青霉素基因（ampr） 农杆菌转化 抗原—抗体杂交 脱分化、再分化

【解析】

结合题意，分析图【解析】
鱼的抗冻蛋白基因上具有三种限制酶切割位点，PstⅠ酶的切割位点存在于目的基因的两侧，SmaⅠ酶的切割位点存在于目的基因的左侧，而AluⅠ酶的切割位点存在于目的基因的中央，因此不宜选用AluⅠ酶（因为它会破坏目的基因的结构）。在选择限制酶时一般选择同种限制酶，以便形成相同的黏性末端。图中①～④分别表示的过程是：基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞、脱分化、再分化。

（1）结合前面的分析可知：在构建基因表达载体中，如果目的基因和载体用同一种限制酶切割，获得的黏性末端相同，将会发生自身环化现象，故应选用不同的限制酶分别对目的基因和载体切割，以获得不同的黏性末端，故应选用PstⅠ和SmaⅠ对含鱼抗冻蛋白基因的DNA、质粒进行切割。PstⅠ和SmaⅠ在鱼抗冻蛋白基因的DNA上共有3个酶切位点，切割后产生4个DNA片段；而环状质粒上有两个酶切位点，切割后产生2个DNA片段。

（2）能在含氨苄青霉素的培养基中正常生长增殖的细胞一定具有抗氨苄青霉素基因（ampr），故基因表达载体Ⅰ中应含有抗氨苄青霉素基因作为标记基因。

（3）将目的基因导入植物细胞的常用方法是农杆菌转化法。在分子水平检测目的基因是否翻译形成了相应的蛋白质，原理是：把该目的基因合成的蛋白质看作抗原，在其中加入特定的抗体，即采用抗原-抗体杂交技术，观察是否出现凝集反应。若出现凝集反应，则说明该目的基因控制合成蛋白质成功；反之，则不成功。

（4）植物组织培养首先需要培养形成愈伤组织，该过程是脱分化③，而愈伤组织经再分化④形成胚状体。