Question

Ⅱ型干扰素是效应T细胞分泌的一种淋巴因子，可用于治疗病毒感染和癌症。科学家将Ⅱ型干扰素基因与大肠杆菌的DNA分子进行了重组，成功地在大肠杆菌中得以表达。

（1）若用PCR技术扩增Ⅱ型干扰素基因，其前提条件是有一段______，以便根据这一序列合成引物。PCR过程需要经过多次循环，每一个循环包括：加热变形→冷却复性→加热延伸，其中冷却复性的目的是______，加热延伸过程中发生最主要的过程是______。

（2）已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点—↓GATC—，Ⅱ型干扰素基因结构如图中所示。

 

①在构建基因表达载体的过程中，用限制酶______切割质粒，用限制酶______切割目的基因。

②将得到的大肠杆菌涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，得到如图a所示的结果（圆点表示菌落），该结果说明能够生长的大肠杆菌中已导入了______。将灭菌绒布按到培养基a上，使绒布表面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图b所示的结果（圆圈表示与图a培养基上对照无菌落的位置）。与图b圆圈相对应的图a中的菌落表现型是______，这些大肠杆菌中导入了______。

Answer

已知核苷酸序列的目的基因 便于引物与互补的DNA链的结合 在70∼75℃时，热稳定的DNA聚合酶把单个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接到引物上，如此逐渐延伸形成互补链 Ⅰ Ⅱ 普通质粒或重组质粒 抗氨苄青霉素但不抗四环素 重组质粒

【解析】

1.获得目的基因的方法：①从基因文库中获取 ②利用PCR技术扩增 ③人工合成（化学合成）。PCR技术的原理是DNA双链复制。利用PCR技术扩增目的基因的前提条件是：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。利用PCR扩增目的基因的过程由高温变性(90∼95℃)、低温复性(55∼60℃)、适温延伸(70∼75℃)三个步骤构成一个循环，在扩增过程中离不开Taq酶(热稳定性DNA聚合酶)的催化。

2.将得到的大肠杆菌B涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，因质粒上有抗氨苄青霉素基因，且重组质粒上的抗氨苄青霉素基因，也没有被破坏，所以如果大肠杆菌B能够生长，说明已导入了含抗氨苄青霉素基因的普通质粒或重组质粒，反之则没有导入。

3.分析题图：图示表示利用基因工程培育工程菌的过程，图中②表示基因表达载体的构建过程，该过程需要限制酶和DNA连接酶；③表示将目的基因导入大肠杆菌的过程，转化后的大肠杆菌经过检测和筛选获得工程菌。

（1）根据以上分析可知，用PCR技术扩增Ⅱ型干扰素基因，其前提条件是有一段已知核苷酸序列的目的基因，以便根据这一序列合成引物。PCR过程冷却复性(55∼60℃)的目的是便于引物与互补的DNA链的结合，加热延伸过程中发生最主要的过程是在70∼75℃时，热稳定的DNA聚合酶把单个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接到引物上，如此逐渐延伸形成互补链，进而使目的基因加倍。

（2）①在构建基因表达载体时，需用限制酶对目的基因和质粒进行切割以形成相同的黏性末端。质粒如果用限制酶Ⅱ来切割的话，将会在质粒在出现两个切口且抗生素抗性基因全被破坏，故质粒只能用限制酶Ⅰ切割（破坏四环素抗性而保留氨苄青霉素抗性，即将来形成的重组质粒能在含氨苄青霉素的培养基中生存，而在含四环素的培养基中不能生存）；目的基因两端都出现黏性末端时才能和质粒发生重组，故目的基因只有用限制酶Ⅱ切割时，才会在两端都出现黏性末端。

②因本题质粒上有2个标记基因，但抗四环素基因被插入的基因破坏掉，因此剩下的是抗氨苄青霉素抗性基因，如果在含氨苄青霉素的培养基上能生长，说明已经导入了重组质粒或普通质粒，因为普通质粒和重组质粒都含有抗氨苄青霉素的基因。与图2中b空圈相对应的图2的a中的菌落表现型是抗氨苄青霉素但不抗四环素，说明这些细菌中导入了重组质粒。