Question

帝王蝶是世界上唯一能长距离迁徙的蝴蝶，其幼虫只摄食一种叫乳草的植物，乳草会分泌 一种名为强心甾的毒素，有资料研究显示，过量摄入强心甾对除帝王蝶幼虫以外其他的动物来说都是有 毒的，会导致死亡。

（1）钠钾泵在许多动物细胞膜上均有存在，它能通过主动转运控制细胞内外的钠、钾离子浓度， 因此从膜蛋白功能的角度看，钠钾泵还具有_____的活性。强心甾能与细胞膜表面的纳钾 泵结合，抑制其主动转运功能，从而导致细胞内外________________失衡，使细胞破裂。

（2）科学家猜测：帝王蝶的钠钾泵基因可能发生了突变，使其获得了对强心甾的抗性。为研究帝 王蝶钠钾泵基因的碱基排列顺序并获得相应的蛋白产物，科学家尝试从帝王蝶基因组中获取该基因，并 通过________ 实现了对其的扩增；科学家选用合适的__________、DNA 连接酶和载体构建重组 DNA 分子，并将其导入大肠杆菌以获得大量的目的基因，再将其导入_______________ 中（A．农杆菌 B．酵母细胞 C．昆虫细胞  D．海拉细胞）获得相应的蛋白产物。

（3）为提高重组 DNA 分子导入的成功率，除了需要确保重组 DNA 分子有足够的物质的量外，还必 须采用各种方法提高大肠杆菌的_________。为了筛选成功导入重组 DNA  分子的大肠杆菌，宜用__________法将转化混合物转移至含有________的平板上。通过基因测序，发现帝王蝶钠 钾泵基因中的突变会导致其蛋白产物中有 3 处氨基酸种类与其他昆虫不同，分别是第 111、119 和 122 位氨基酸，这体现了基因突变的普遍性。

（4）为了从受体细胞中分离目的基因的蛋白产物（目的蛋白），科学家在目的蛋白的肽链末端添加 一个含有 6-10 个组氨酸的“标签”，该标签在适宜条件下可以与含有金属离子的固定化介质结合。因此， 可以提取受体细胞的______中的全部蛋白质，通过_____法将其中的目的蛋白固定在层析 柱上，再洗去不需要的杂蛋白，最后将目的蛋白从层析柱上______下来，从而获得纯度较高的 目的蛋白。通过对目的蛋白的研究发现：上述 3 个位点的突变使得帝王蝶膜结构上钠钾泵的____发生了改变，强心甾无法与其结合，由此验证了之前的猜测。

（5）为进一步研究上述突变位点的作用，科学家使用 CRISPR/Cas9 技术在果蝇中开展了相关研究。

通过该技术，研究人员可以在 DNA 分子中特定的序列处剪切 DNA 分子并进行编辑。研究人员将基因 编辑所需的各种元件同时导入果蝇____细胞中，对钠钾泵基因上的相应位点进行编辑，实验 结果如下：

突变情况	神经系统功能	强心甾抗性
无突变	+++	-
111	+	+
119	+++	-
122	--	++
111+119	++	++
122+119	+	+++
111+119+122	++	++++

注：“+”表示神经系统功能正常或有强心甾抗性“-”表示神经系统功能不正常或没有强心甾抗性

根据上表分析，可以推断出：_____突变对果蝇正常生存影响最小，__________突变则可能是在帝王蝶进化过程中最后出现的，3 个位置先后出现的突变使得帝王蝶在保证神经系统正常功能的 前提下，还进一步获得了对强心甾的抗性，这体现了进化论中________的思想。

Answer

ATP 水解酶 渗透压/Na+、K+离子浓度差 PCR 限制性核酸内切酶 C 细胞壁通透性 稀释涂布 筛选标记物 细胞膜 吸附法 洗脱 空间结构/结构 受精卵 119 122 微小变异累积成显著变异

【解析】

基因工程的基本操作程序

第一步：目的基因的获取

原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。

第二步：基因表达载体的构建

第三步：将目的基因导入受体细胞

常用的转化方法：

将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。

将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术．此方法的受体细胞多是受精卵。

将目的基因导入微生物细胞：最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用Ca2+处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。

第四步：目的基因的检测和表达

采用DNA分子杂交技术，抗原-抗体杂交，个体生物学水平。

（1）钠钾泵能够转运钠离子和钾离子是主动运输需要消耗能量，所以其能够将ATP水解为主动运输功能，其具有ATP水解酶的活性，转运钠离子和钾离子可以维持细胞内外离子平衡，所以。强心甾能与细胞膜表面的纳钾泵结合，抑制其主动转运功能，从而导致细胞内外渗透压Na+、K+离子浓度差失衡。

（2）对目的基因的扩增常采用PCR技术，重组DNA分子的构建需要合适的限制性核酸内切酶、DNA连接酶和载体。

由于该目的基因是从帝王蝶的基因组中获得的，而帝王蝶属于昆虫类生物，所以在获得大量的目的基因后，需要将其倒入昆虫细胞中使其基因表达，获得相应的蛋白产物。

故选C。

（3）为提高重组DNA分子导入的成功率，必须采用各种方法提高大肠杆菌的细胞壁的通透性。为筛选成功导入重组DNA分子的大肠杆菌，需要用稀释涂布平板法将其转移至含有筛选标记物的平板上。

（4）受体蛋白主要分布在细胞膜上，所以可以提取受体细胞的细胞膜中全部的蛋白质，通过吸附法将其固定在层析柱上，再洗去不需要的杂蛋白，最后将目的蛋白从层析柱上洗脱下来。基因中3个位点的突变可能使钠钾泵的空间结构发生改变。

（5）基因工程中如果是动物一般选择受精卵作为受体细胞。从表格中数据分析，第119突变和没有突变的结果相似，所以对果蝇正常生存影响最小；

比较111、119和122，可以发现神经系统功能越正常，强心甾抗性越弱，所以可以看出122突变神经系统功能最弱，强心甾抗性最强，有可能是帝王蝶进化过程中最后出现的；

3个位置先后出现的突变使得帝王蝶在保证神经系统正常功能的前提下，还进一步获得了对强心甾的抗性，这体现了进化论中微小变异累积成显著变异的思想。