Question

Brazzein是一种天然植物甜味蛋白，具有甜度高、能量低、稳定性好等优点，未经折叠的 Brazzein的甜味明显下降。因产 Brazzein的植物生长条件苛刻，在原产地之外不能结实，所以人们利用基因工程技术，让 Brazzein基因在微生物、真菌和动植物体内表达，并都取得了一定进展。请回答下列问题：

（1）为获得 Brazzein基因需构建cDNA文库，该过程要以mRNA为模板，构建的cDNA文库__________（填“含有”或“不含”）启动子序列。利用PCR技术扩增从cDNA文库中获取的目的基因时需要目的基因中一段已知的核苷酸序列，以便根据这一已知序列合成____________________。

（2）将人工合成的Brazzein基因导入大肠杆菌时要先用Ca²⁺处理大肠杆菌，其目的是____________________；再将重组基因表达载体溶于缓冲液中与大肠杆菌混合。若要让 Brazzein从动物的乳汁中获得，需将 Brazzein基因和____________________重组在一起，并且选用__________作为受体细胞。

（3）从大肠杆菌中获得的Brazzein的甜味远远不及从动物的乳汁中获得的 Brazzein，导致这种现象的原因是________________________________________________________________________________。

Answer

不含 引物 增大细胞膜的通透性，使细胞容易吸收外源DNA 乳腺蛋白基因启动子等调控组件 能发育成雌性动物的受精卵 大肠杆菌没有内质网和高尔基体，不能将Brazzein折叠形成一定的空间结构

【解析】

基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因―DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质―抗原―抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）构建基因组文库时，需要用到的酶主要有限制酶和DNA连接酶；cDNA是由mRNA逆转录形成的，因此构建cDNA文库时还需要用到的酶主要是逆转录酶。mRNA逆转录形成的cDNA中不含启动子、终止子等控件。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，其目的是根据这一序列合成引物。扩增目的基因的过程中，DNA解链为单链，后要适当降低反应体系温度，以便引物与模板结合，即低温复性。

（2）若受体细胞是大肠杆菌，可先用Ca2+处理细胞，使其成为感受态状态，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与大肠杆菌混合；若受体是哺乳动物，受体细胞是雌性动物的受精卵，需将Brazzein基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，以便从乳汁中获得大量的Brazzein蛋白。

（3）Brazzein是一种天然植物甜味蛋白，属于分泌蛋白，其合成和分泌过程中需要内质网和高尔基体的加工，而大肠杆菌细胞中没有内质网和高尔基体，不能对其进行加工，因此从大肠杆菌中获得的Brazzein不能达到期待的生物活性。