Question

[生物——选修1：生物技术实践]

针对蔬菜废弃物纤维素降解慢的难题，从自然界中采集堆肥、枯树叶等样品进行分离，筛选分解能力较强的纤维素分解菌。某研究小组探究了温度对纤维素分解菌分解能力的影响，实验步骤如下：①纤维素分解菌的筛选、分离及纯化→②纤维素分解菌菌株数量的测定→③纤维素酶活力测定和降解滤纸能力的检测。请回答下列问题：

（1）步骤①中，用________法将1 mL菌液逐步稀释成10^-6的悬浊液。为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基（成分见下表）：

	酵母膏	无机盐	淀粉	纤维素粉	琼脂	CR 溶液	水
培养基甲	+	+	+	+	-	+	+
培养基乙	+	+	+	-	+	+	+

注："+"表示有，"-"表示无。

据表判断，培养基甲_____（填"能"或"不能"）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是________；培养基乙________（填"能"或"不能"）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是____________。某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是____。

（2）对土壤中该类微生物进行计数，则步骤①采用的接种方法是______________。

（3）纤维素酶的测定方法，一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的________进行定量测定的方法。

Answer

梯度稀释 不能 液体培养基不能分离单菌落且纤维素不是唯一碳源 不能  培养基乙中没有纤维素，不会形成CR-纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌 菌液浓度过高（土壤溶液稀释不够） 稀释涂布平板法 葡萄糖

【解析】

微生物产生的纤维素酶是一种复合酶，包括内切酶（Cx酶）、外切酶（C1酶）和葡萄糖苷酶。内切酶作用于无定型的纤维素区域，使纤维素断裂成片段；外切酶又叫纤维二糖水解酶，它可以作用于纤维素的结晶区或小片段纤维素，从糖链末端开始切掉两个葡萄糖分子，产生纤维二糖；葡萄糖苷酶则将纤维二糖分解成葡萄糖。刚果红可以与象纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，而不与水解后的纤维二塘和葡萄糖发生这种反应。

步骤①中，若用稀释涂布平扳法接种，则必须将菌液进行一系列的梯度稀释。

（2）分析表格可知，培养基甲为液体培养基且纤维素不是唯一碳源，不能用于分离和鉴别纤维素分解菌，纤维素分解菌鉴别培养基属于固体培养基；培养基乙没有纤维素，不会形成CR-纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌，因此也不能用于分离和鉴别纤维素分解菌。某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是菌液浓度过高（土壤溶液稀释不够），为避免此种现象，应对菌液进行梯度稀释（加大稀释倍数）。
（3）稀释涂布平板法不仅能实现微生物的分离，还能用于微生物的计数。

（4）为了确定是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验。纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。