Question

某植物蛋白酶抑制剂Ⅱ基因是重要的抗虫基因，该基因转录的mRNA下游序列已知，但其上游序列未知。现利用PCR等技术扩增该基因，具体原理如下图所示，其中①〜③表示有关过程，Ⅰ〜Ⅲ表示有关物质。请回答下列问题：

（1）过程①反应体系中，需要加入_________ 种引物，还需加入_________ 酶，生成杂合链物质Ⅰ。

（2）利用DNA末段转移酶催化过程②，使cDNA单链左侧末端增加十多个腺嘌呤脱氧核苷酸序列（AAA(A)n），其目的是_________________，进而利于过程③扩增获得目的基因序列Ⅲ，过程③反应体系需要添加的新引物序列是____________________ 。该过程需_________酶。

（3）与物质Ⅲ相比，物质Ⅰ化学组成不同的是____________________。

（4）在物质Ⅲ的两端通常还需要增加______________ 序列，以便与相应的载体重组，再利用 ________ 处理大肠杆菌等，以利于将重组质粒导入细胞，构建cDNA文库。

Answer

1 逆转录 便于设计引物 TTT（T）n Taq酶 具有尿嘧啶和核糖 限制酶识别 Ca2+

【解析】

据图分析，过程①表示以mRNA为模板逆转录形成DNA的过程，需要1种引物；过程②表示在DNA末端转移酶催化下，在cDNA单链左侧末端增加十多个腺嘌呤脱氧核苷酸序列（AAA(A）n)的过程；过程③表示利用PCR技术扩增目的基因的过程。

（1）根据以上分析可知，过程①表示表示以mRNA为模板逆转录形成DNA的过程，需要1种引物，且需要逆转录酶的催化。

（2）利用DNA末段转移酶催化过程②，使cDNA单链左侧末端增加十多个腺嘌呤脱氧核苷酸序列（AAA(A)n），其目的是便于设计引物，因此在过程③扩增获得目的基因序列Ⅲ时，反应体系需要添加的新引物序列是TTT(T)n，该过程需具有耐高温的DNA聚合酶，即Taq酶。

（3）据图分析可知，物质Ⅲ的两条链都是DNA链，而物质Ⅰ的一条链是DNA链，一条链是RNA链，因此物质Ⅰ的化学组成与物质Ⅲ相比，不同之处在于物质Ⅰ中含有核糖和尿嘧啶。

（4）根据题意分析，过程③表示利用PCR技术扩增目的基因的过程，因此在目的基因（物质Ⅲ）的两端通常还需要增加限制酶的识别序列，以便限制酶的识别与切割，然后与相应的载体重组；将重组质粒导入大肠杆菌前，需要先用钙离子处理大肠杆菌，使之成为感受态。