Question

荸荠又称马蹄，是一种果蔬兼用型的经济作物，在生产实践中发现，洗得干净的荸荠在贮藏过程中往往比带泥荸荠更容易失水腐烂。研究者从荸荠表面泥土中分离出一些拮抗细菌，并发现2株拮抗细菌发酵滤液对荸荠表面细菌、霉菌具有显著的抑制作用，为荸荠贮藏过程中新型生物贮藏保鲜技术的开发提供了一定的理论依据。分离纯化拮抗细菌的操作如下，请回答：

（1）从新鲜的带泥荸荠中分离出泥土样后，将样品稀释至一定浓度范围，以保证获得菌落数在________之间的计数平板，稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作，目的是确保________。

（2）吸取1mL稀释液涂布到培养基上培养，制备固体培养基时应加入_________，培养基采用________法灭菌。

（3）从培养基上挑选出菌落形态不同的单菌落若干，培养24h后，取菌液划线于培养基中，获得单菌落，重复3次，获得纯化菌株，划线时应注意从________开始划；为了防止水蒸汽凝结成的水珠影响平板内菌落生长，培养时应将培养皿________。

（4）研究发现2株细菌的发酵液对荸荠表面细菌、霉菌具有显著的抑制作用，为长期保存这两种菌种，可采用________法保存，并放在________℃的冷冻箱中。

Answer

30~300 无菌 琼脂 高压蒸汽灭菌 上次划线的末端 倒置 甘油管藏 -20℃

【解析】

微生物的实验室培养常用到培养基，培养基按物理状态分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基，固体培养基通常需要加入琼脂凝固。培养基需要灭菌后才能用来培养细菌。单菌落分离法包含划线分离法和涂布分离法，常用于分离获得单菌落。微生物的研究通常包含微生物的获得、分离纯化、培养以及保存等。

（1）通过统计菌落数来计算细菌的数量，在接种时以保证获得菌落数在30~300之间的平板，才不会出现细菌数太少或生长时叠加的情况。稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作，目的是确保无菌。

（2）固体培养基配制时应加入琼脂，并用高压蒸汽灭菌后备用。

（3）划线分离应从上次划线的末端开始划，由于划线过程中接种环上的菌液逐渐减少，最后可能得到单菌落。培养皿倒置培养可以防止水滴掉入冲散单菌落。

（4）甘油具有吸湿、保水的性质，常用来长期保存菌种，通常菌种可以放在-20℃的冰箱中保存。