Question

血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O₂或CO₂的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。   

（1）将实验流程补充完整:A为血红蛋白的释放，B为_______。凝胶色谱法是根据____________而分离蛋白质的有效方法。 

（2）洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白（血浆蛋白），洗涤次数过少，无法除去______;离心速度过高和时间过长会使_________一同沉淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标志是_____________。释放血红蛋白的过程中起作用的是___________。 

（3）在洗脱过程中加入物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7.0）的目的是_________________。如果红色区带__________，说明色谱柱制作成功。

Answer

样品的加入和洗脱 相对分子质量的大小 血浆蛋白 白细胞和淋巴细胞 离心后的上清液中没有黄色 蒸馏水和甲苯 准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内一致 均匀一致地移动

【解析】

1、血红蛋白的提取与分离的实验步骤主要有：

（1）样品处理：①红细胞的洗涤，②血红蛋白的释放，③分离血红蛋白。

（2）粗分离：①分离血红蛋白溶液，②透析。

（3）纯化：调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质。

（4）纯度鉴定--SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2、分析题图：A表示血红蛋白的释放，B表示样品的加入和洗脱。

（1）样品处理过程为：红细胞的洗涤→血红蛋白的释放→分离血红蛋白溶液→透析，所以A表示血红蛋白的释放，B表示样品的加入和洗脱；凝胶色谱法的原理是分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。
（2）洗涤红细胞的目的是去除杂质蛋白，释放血红蛋白的过程是让红细胞吸水胀破。如果分层不明显，可能是洗涤次数少，未能除去血浆蛋白的原因；此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度；重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净；由于甲苯是表面活性剂的一种，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，而蒸馏水可使红细胞吸水涨破细胞膜。
（3）磷酸缓冲液（pH为7.0）能够准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内的一致；如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢均匀一致地移动，如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。