Question

科研人员利用大肠杆菌构建了抗虫基因文库。最新研究发现漏斗蜘蛛中的AH基因控制合成的毒素肽具有显著的杀虫效果，现以p-B质粒为载体，构建AH基因的cDNA文库。图1表示p-B质粒，其中Cm!r表示氯霉素抗性基因，ccdB 基因表达产物能抑制大肠杆菌DNA复制。图中箭头表示相关限制酶的酶切位点，且不同种限制酶识别序列不同，其中Aiu I、Xba I、Ssp I和Mfe I识别的碱基序列和酶切位点分别是AGLCT、T4CTAGA、AATIATT、 CIAATTG。请分析回答：

 （1）为获得AH基因的cDNA，先要从漏斗蜘蛛毒素肽分泌细胞中提取_________， 再利用反应体系中添加__________， 从而准确合成出AH基因的cDNA，排除其他提取物的干扰。若从漏斗蜘蛛其他组织细胞提取，则难以成功，原因是其他组织细胞中_________。

（2）利用图中的质粒和AH基因构建重组质粒时，宜选用________双酶切质粒， 再选用_________切割目 的基因，将切割后获得的DNA片段混合，经DNA连接酶处理后，再与大肠杆菌混合培养，在含有适量氯霉素的培养基中添加适量冷冻的________，以促进转化。

（3）经上述处理培养后，获得存活的大肠杆菌中应含有的质粒是________，原因是_________。

Answer

RNA 特异性引物 AH基因不表达 Aiu和MfeI SspI和MfeI CaCl2（或Ca2+） 重组质粒 重组质粒中的ccdB基因被破坏，不能抑制DNA复制

【解析】

基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：

分子水平上的检测：

①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；

②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；

③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。

个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）cDNA是以RNA为模板逆转录而成的，因此为获得AH基因的cDNA，先要从漏斗蜘蛛毒素肽分泌细胞中提取RNA，再利用反应体系中添加的特异性引物，从而准确合成出AH基因的cDNA，排除其他提取物的干扰。若从漏斗蜘蛛其他组织细胞提取，则难以成功，原因是存在基因的选择性表达，其他组织细胞中AH基因不表达。

（2）质粒中含有多种限制酶识别序列，但用限制酶XbaI切割会破坏复制原点，因此不能用该酶切割；由于ccdB基因表达产物能抑制大肠杆菌DNA复制，因此构建基因表达载体时，应该破坏该基因，即需要用限制酶MfeI切割；若用Sph I和MfeI切割会导致启动子丢失，因此不能用限制酶SphI切割；若用MfeI和SacI切割则不能获取目的基因AH。综合以上可知，利用图中的质粒和AH基因构建重组质粒时，宜选用AiuI（产生平末端）和Mfel双酶切质粒，再选用Sspl（产生平末端）和Mfel切割目的基因。将切割后获得的DNA片段混合，经DNA连接酶处理后，再与大肠杆菌混合培养，在含有适量氯霉素的培养基中添加适量冷冻的CaCl2（或Ca2+），使受体细胞成为易于吸收周围环境中DNA分子的感受态细胞，以促进转化。

（3）由于重组质粒中的ccdB基因被破坏，不能抑制DNA复制，因此获得的存活的大肠杆菌中应含有的质粒是重组质粒。