Question

图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp Ⅰ、BamH Ⅰ、Mbo Ⅰ、Sma Ⅰ4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：

（1）图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由______连接。

（2）若用限制酶Sma Ⅰ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是_____末端，其产物长度为_____。

（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶Sma Ⅰ完全切割，产物中共有_____种不同DNA片段。

（4）若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是_____。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加_____的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是_______________。

Answer

脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖 平 537bp、790bp、661bp 4 BamH I 抗生素B 同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接

【解析】

图1中DNA片段含有2个限制酶SmaⅠ切割位点，基因D两侧序列为GGATCC，可被限制酶BamHⅠ切割。图2中：质粒含有CCGG序列、GGATCC序列和GATC序列。

（1）脱氧核苷酸链相邻两碱基之间依次是脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖。

（2）Sma Ⅰ酶切点是CCC↓GGG，所以产生末端是平末端，根据图1中的酶切位点，可判断用限制酶SmaⅠ完全切割该DNA片段，左边534+3=537bp，中间796-6=790bp，右边658+3=661bbp三个片段。

（3）由图可知目的基因D有2个酶切位点，杂合子D可以切成3种不同长度的，突变后的d只有1个酶切位点可以切成2种不同长度的，其中有1种是和D相同，故共产生4种不同长度的片段。

（4）由图可知目的基因要完全切割下来可以用BamHI酶，用MboI酶也可以，同样质粒上也都有该酶切位点，但用MboI酶切后会将质粒上的2个抗性基因都破坏掉无法进行筛选，用BamHI酶切后质粒的抗生素A基因被破坏，故只能用含抗生素B的培养基鉴定。目的基因连进入但不能正确表达最可能的原因是因为同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接。