Question

脊椎动物的巨噬细胞可将病原体抗原片段通过组织相容性复合物（MHC）展示在细胞的外表面（如下图所示），进而刺激天然T细胞的表面受体（TCR）。天然T细胞很难被肿瘤表面抗原所激活，但一旦激活便能高效杀灭肿瘤细胞。另一方面，抗体能高效识别肿瘤表面抗原，但却不能有效杀灭肿瘤细胞。通过下图所示的基因工程方案构建T细胞嵌合型抗原受体（ CAR）可以解决上述问题。

（1） 临床上采用患者免疫细胞的基因并借助基因工程技术构建T细胞嵌合型抗原受体（ CAR）。据图分析该技术所使用的目的基因是____________________________。图中的步骤②是基因工程的核心步骤，完成这一步骤需要的工具酶是_______________________。

（2）体外培养CAR-T细胞时，培养基中除水、糖、氨基酸、无机盐、微量元素、促生长因子外，通常还需要加入__________和抗生素；传代培养时，贴满瓶壁的细胞需要用_______处理后分瓶继续培养。

（3）据图分析，CAR-T 细胞杀灭肿瘤细胞的过程属于_________免疫。

（4）天然 T 细胞与 CAR-T 细胞在结构和功能上都有差异。从结构角度看，天然T细胞的细胞膜上识别抗原的是 TCR，而CAR-T 细胞识别抗原的是________；从功能角度看，天然T 细胞能杀死肿瘤细胞却不能高效识别肿瘤抗原，而CAR-T 细胞则____________。

Answer

TCR跨膜区基因和抗体基因 限制酶和DNA连接酶 动物血清 胰蛋白酶（或胶原蛋白酶） 细胞（或特异性） CAR（嵌合型抗原受体） 既能高效识别肿瘤抗原也能高效杀灭肿瘤细胞

【解析】

1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

2、取动物组织块——剪碎组织——用胰蛋白酶处理分散成单个细胞——制成细胞悬液——转入培养液中（原代培养）——放入二氧化碳培养箱培养——贴满瓶壁的细胞用酶分散为单个细胞制成细胞悬液——转入培养液（传代培养）——二氧化碳培养箱。

（1）通过图示中的①可知，该基因工程所使用的目的基因是TCR跨膜区基因和抗体基因。图中步骤②是基因表达载体的构建，完成这一步骤需要用限制酶切开质粒，再用DNA连接酶把目的基因和质粒连接形成重组DNA分子，因此用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶。

（2）CAR-T细胞为动物细胞，体外培养动物细胞时，培养基中除水、糖、氨基酸、无机盐、微量元素、促生长因子外，通常还需要加入动物血清、抗生素，动物血清可以提供一个类似生物体内的环境，抗生素可以抑制杂菌的生长。细胞外含有多种胞外蛋白，如胶原蛋白，使细胞间或细胞与培养瓶内壁粘连起来，用胰蛋白酶处理这些蛋白质后就可以使它们分开。

（3）体液免疫主要靠B细胞起作用，细胞免疫主要靠T细胞起作用。CAR-T细胞为转基因T细胞，通过与肿瘤细胞（靶细胞）表面抗原密切接触，从而杀灭肿瘤细胞，因此属于细胞免疫。

（4）从结构角度看，二者细胞膜上识别抗原的受体不同，天然T细胞的细胞膜上识别抗原的是TCR，而CAR-T细胞识别抗原的是CAR。从功能角度看，天然T细胞能杀死肿瘤细胞却不能高效识别肿瘤抗原，而CAR-T细胞是转基因细胞，既能高效识别肿瘤抗原也能高效杀灭肿瘤细胞。