Question

嵌合抗原受体T细胞免疫技术（简称CAR－T技术）是目前较为有效的治疗恶性肿痛的方式之一。该技术的原理是用基因工程技术，把从患者体内获取的T细胞加入一个能识别癌细胞同时激活T细胞的嵌合抗体（CAR），赋子T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力。回答下列问题。

（1）正常细胞发生癌变主要与_________突变相关。

（2）体外培养从患者体内获取的T细胞必须保证无菌无毒的环境，具体措施_________（答出两点即可）。

（3）该技术的关键是制备针对癌细胞的特异性抗体。可以将癌细胞表面抗原注入小鼠体内，从小鼠血液中分离特异性抗体。然后，分析该抗体的氨基酸序列，推导其应有的_________序列，然后通过________（填仪器）合成相应基因（CAR基因）。获取的基因经进一步修饰后可利用___________（填方法）导入T细胞。

（4）为检测CAR基因在T细胞内是否正常转录，需要提取T细胞的总mRNA与以___________为探针进行杂交，以筛选能够正常转录的CAR－T细胞。

（5）筛选的CAR－T细胞在回输病人体内前，还需进行___________检测和体外扩增，以确保其其有治疗癌症的效果。

Answer

原癌基因和抑癌基因 对培养液和所有用具进行无菌处理、在培养液中添加一定量抗生素、定期更换培养液防止细胞代谢产物积累对细胞造成危害等 核苷酸（或脱氧核苷酸或基因） DNA合成仪 显微注射法 放射性同位素标记的CAR基因 功能

【解析】

细胞癌变的内因：原癌基因和抑癌基因发生基因突变，其中原癌基因负责调节细胞周期，控制细胞生长和分裂的过程，抑癌基因主要是阻止细胞不正常的增殖；蛋白质工程的基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）以上是蛋白质工程特有的途径；以下按照基因工程的一般步骤进行。

（1）细胞发生癌变的原因是原癌基因和抑癌基因发生突变。

（2）动物细胞培养时为营造无菌无毒的环境，可以通过以下措施实现：对培养液和所有用具进行无菌处理、在培养液中添加一定量抗生素、定期更换培养液防止细胞代谢产物积累对细胞造成危害等；

（3）制备特异性抗体时可以将癌细胞表面抗原注入小鼠体内，从小鼠血液中分离特异性抗体。然后，分析该抗体的氨基酸序列，推导其应有的核苷酸序列，然后通过DNA合成仪合成相应基因（CAR基因）；将目的导入动物细胞（T细胞）的方法为显微注射技术。

（4）为检测目的基因是否转录，需要提取T细胞的总mRNA与以放射性同位素标记的目的基因（CAR基因）为探针进行杂交，若出现杂交带，则证明转录成功。

（5）为确保CAR－T细胞有治疗癌症的效果，在回输病人体内前需进行功能检测和体外扩增。