Question

ACC合成酶是乙烯合成过程中的关键酶，由ACC合成酶基因（简称A基因）控制合成。将A基因反向连接在启动子和终止子间可构成反义ACC合成酶基因（A1基因），转A₁基因番茄的后熟过程变慢，利于番茄的储藏和运输。

请回答：

（1）从番茄的果肉细胞中提取RNA，利用RT－PCR获取A基因，即利用RNA和PCR技术获取目的基因。利用RT－PCR获取A基因所需要的酶主要有___________。在A基因扩增过程中需要特定的引物，该引物的作用是_____________________________。

（2）S₁和S₂为A基因和A₁基因的特异性启动子，S₂在番茄果肉细胞内起作用，S₁在除果肉细胞外的其他细胞内起作用。在构建转A₁基因表达载体时，启动子应选择____________，不选另一个的理由是___________________。A₁基因的表达元件包括启动子、终止子以及反向连接在两者之间的A基因，若用农杆菌转化法将此元件整合到番茄细胞的染色体DNA上，则应将此元件应构建在Ti质粒的____________中。

（3）在检测番茄细胞的染色体DNA上是否插入了A₁基因时，__________（填“能”“不能”）用放射性物质标记的A基因做探针进行检测，理由是________________________。检测表明，与非转基因番茄相比，转A₁基因蕃茄的果肉细胞内乙烯含量下降，机理是______________________________。

Answer

逆转录酶和Taq酶 定位A基因的位置，与模板链结合并为子链的延伸提供起点 S2 S1不在果肉细胞内起作用，番茄果实不会后熟；S1在番茄植株细胞内起作用后会导致番茄植株的乙烯合减少，影响番茄植株的正常生理活动 T-DNA 不能 蕃茄细胞内本身有A基因，无论是否插了A1基因都能与探针杂交形成杂交带 转基因番茄细胞中存有A基因与A1基因，二者转录产生的mRA能杂交形成双链，导致ACC合成酶的合成受阻，从而使乙烯的合成量降低

【解析】

基因工程的操作步骤：1.提取目的基因、2.构建基因表达载体、3.将目的基因导入受体细胞、4.目的基因的检测和鉴定。PCR技术可扩增目的基因，该技术需要耐高温的DNA聚合酶和引物，其中引物的作用是定位要扩增DNA的区段，与模板链结合并为子链的延伸提供起点。

（1）由RNA经RT-PCR技术获取了cDNA，进而获得A因，故RT-PCR技术包含了逆转录和PCR两个过程，因此需要逆转录酶和Taq酶。引物和模板结合后，定位了要扩增DNA的区段，即定位A基因。由于Taq酶只能从单链的3′端延伸，因此引物提供了子链的延伸起点。

（2）S1在番茄的植株细胞内起作用，不在果肉细胞内起作用，番茄果实不会后熟，因此启动子应选择S2。同时也考虑到S1在番茄植株内起作用后会导致番茄植株的乙烯合减少，影响番茄植株的正常生理活动。T-DNA是Ti质粒的可转移区段，表达元件应构建在Ti质粒的T-DNA上。

（3）茄细胞内本身有A基因，无论是否插入了A1基因，A基因A1基因都能与探针杂交形成杂交带，因此不能用放射性物质标记的A1基因做探针进行检测。

（4）在转A1基因的番茄果肉内，同时存有A基因和A1基因，二者转录产生的两种mRNA的碱基互补，会通过核酸分子杂交杂交形成双链，从而导致ACC合成酶的合成受阻，最终使乙烯的合成量与含量下降，使番茄的后熟过程变慢。