Question

金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：

（1）从高表达MT 蛋白的生物组织中提取mRNA，通过___________获得___________用于PCR扩增。

（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的____________位点。设计引物时需要避免引物之间形成____________，而造成引物自连。

（3）图中步骤1代表变性，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏____________的碱基配对。

（4）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有____________ （填序号：①升高退火温度 ②降低退火温度 ③重新设计引物）。

Answer

逆转录 cDNA 限制性核酸内切酶 碱基互补配对 引物与模板 ②③

【解析】

PCR技术：

1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；

2、原理：DNA复制；

3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物；

4、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；

5、过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链．PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。

（1）PCR扩增目的基因，首先要有目的基因作为模板，所以从高表达MT 蛋白的生物组织中提取mRNA，通过逆转录获得cDNA，从而用于PCR扩增。

（2）构建重组质粒，首先要用限制酶切割含目的基因的DNA片段和质粒，所以位于目的基因两端的引物中需要增加适当的限制性核酸内切酶位点。设计的引物之间不能有碱基互补配对，否则引物自连，而不能与模板相连。

（3）退火表示引物与模板相连，若退火温度过高会破坏引物与模板的碱基配对。

（4）PCR反应得不到任何扩增产物，可能是退火温度过高，导致引物与模板不能相连；或引物间相互配对，引物自连，不能与模板相连。因此，可通过降低退火温度或重新设计引物进行改进。