Question

为增加油葵种子中的含油量，科学家尝试将花生中的酶A基因导入油葵细胞，获得转基因油葵新品种。

（1）为获取目的基因，可从花生细胞中提取_________，经逆转录形成cDNA。以此cDNA为模板通过PCR技术扩增目的基因。

（2）构建重组DNA分子（如图所示）最好选用_________限制酶，目的是可避免_________。

（3）普通大肠杆菌细胞中没有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因，将构建的重组DNA分子导入农杆菌中,将获得的农杆菌接种在含_________的固体平板上培养得到含重组质粒的单菌落，再利用培养基震荡培养，可以得到用于转化的浸染液。

（4）剪取油葵的叶片放入浸染液中一段时间后，经过筛选获得转基因油菜细胞。最后经过__________________

培育成转基因油葵植株。此种技术的原理是_________。

（5）研究发现，如果将该酶A的20位和24位氨基酸变为半胱氨酸，其催化能力将提高2倍。通过蛋白质工程对酶A进行改造，所需步骤有_________。        

a．蛋白质的结构设计                 b．蛋白质的结构和功能分析

c．蛋白质结构的定向改造             d．酶A基因的定向改造

e．将改造后的酶A基因导入受体细胞       f．将定向改造的酶A导入受体细胞

（6）经过种植转基因油葵发现，虽然转基因油葵种子中含油量上升，但是抗灰霉菌的能力丢失，其原因是_________。

Answer

mRNA BamHⅠ和 PstⅠ 质粒自身的黏性末端连接或目的基因与质粒反向连接 氨苄青霉素 植物组织培养技术 植物细胞的全能性 b、a、d、e 抗灰霉菌基因没有表达（或丢失等）

【解析】

基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）逆转录过程需要从供体细胞内提取出的 mRNA 为模板，以脱氧核苷酸为原料合成 cDNA。

（2）构建重组 DNA 分子时选用的限制酶要不破坏目的基因，所以不能用 EcoR I，同时尽量防止质粒自身的黏性末端连接或目的基因与质粒反向连接，所以最好选用两种限制酶， 即 BamHⅠ和 PstⅠ。

（3）根据限制酶的切割位点，由于使用 BamHⅠ和 PstⅠ会破坏抗四环素标记基因，但抗氨苄青霉素的标记基因是完整的所以只能用含氨苄青霉素的培养基筛选含重组质粒的单菌落。

（4）得到转基因细胞后，要培养转基因植株，需要用植物的组织培养技术才能实现，其依据的原理是植物细胞的全能性。

（5）蛋白质工程的步骤是：蛋白质的结构和功能分析→蛋白质的结构设计→酶 A 基因的定向改造→将改造后的酶 A 基因导入受体细胞→获得所需蛋白质。

（6）转基因油葵种子中含油量上升，但抗灰霉菌的能力丢失，原因可能是抗灰霉菌基因未表达或丢失。