Question

研究人员利用小鼠(2N＝40)的单倍体ES细胞(只含一个染色体组)，成功培育出转基因小鼠。其主要技术流程如下图所示：

注：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ代表四种限制酶，箭头指向的位置为限制酶的切割位置，Amp^r是氨苄青霉素抗性基因，Neo^r是G418抗性基因。

（1）重组质粒上的抗生素抗性基因可作为________，其作用是有利于筛选出含有目的基因的细胞。氨苄青霉素不能有效杀死小鼠细胞，而一定浓度的G418能有效杀死不具有Neo^r的小鼠细胞，结合上图推测，过程①选用的2种限制酶是________(选填图中的编号)，图中③处的培养液应添加________________(填氨苄青霉素或G418 )。

（2）若图中过程①选用的2种限制酶识别序列和切割位置分别是和，则经这两种限制酶切割后所产生的黏性末端是______。此时，图中过程②应选用______(填E·coli DNA连接酶或T₄DNA连接酶)。

（3）据图分析，细胞乙内除线粒体DNA外，还有________个DNA分子；细胞乙发育成桑堪胚的过程中细胞分裂方式是____________，将细胞乙培养成桑椹胚的技术称为________技术，该胚胎中每个细胞的体积变化是_______。

（4）下列关于质粒运载体的说法正确的是________。

A．没有限制酶就无法使用质粒运载体

B．质粒运载体只能在与目的基因重组后进入细胞

C．质粒运载体可能是从细菌或者病毒的DNA改造的

D．质粒运载体的复制和表达也遵循中心法则

E．质粒运载体只有把目的基因整合到受体细胞的DNA中才能表达

Answer

标记基因 Ⅰ和Ⅱ G418 T4DNA连接酶 40 有丝分裂 早期胚胎培养 减小 AD

【解析】

1、分析图【解析】
图中过程①表示利用限制酶切割目的基因和质粒，过程②表示利用DNA连接酶构建重组质粒，过程③表示将重组质粒导入小鼠单倍体ES细胞后对该细胞进行培养、筛选，经过细胞核移植后对获得细胞核的卵母细胞进行早期胚胎培养。
2、两种DNA连接酶（E•coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：
①相同点：都缝合磷酸二酯键。②区别：E•coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率较低。

（1）重组质粒上的抗生素抗性基因可作为标记基因，其作用是有利于筛选出含有目的基因的细胞。根据题意可知，氨苄青霉素不能有效杀死小鼠细胞，而一定浓度的G418能有效杀死不具有Neo′的小鼠细胞，因此应选择Neo′作为标记基因，即质粒上Neo′不能用限制酶切割，则过程①应选用Ⅰ和Ⅱ两种限制酶，图中③处的培养液应添加G418以便于起到筛选的作用。

（2）若图中过程①选用的两种限制酶识别序列和切割位置分别是和，前者被限制酶切割形成的是黏性末端，后者被限制酶切割形成的是平末端，即经这两种限制酶切割后所产生的黏性末端是，此时，图中过程②应选用T4DNA连接酶。
（3）根据题意可知，小鼠的染色体为2N=40，因此单倍体ES细胞的细胞核中染色体有20条，完成减数分裂后的卵细胞中也有20条染色体，即细胞乙内除线粒体DNA外，细胞核中有40个DNA分子；细胞乙发育成桑椹胚的过程中细胞分裂方式是有丝分裂，将细胞乙培养成桑椹胚的技术称为早期胚胎培养技术。卵裂过程中细胞的体积减小，所以该胚胎中每个细胞的体积将减小。
（4）质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
A、质粒作为运载体，必须有限制酶的切割位点，才能与目的基因整合重组，A正确；
B、质粒运载体与目的基因没有成功重组也会被导入受体细胞，B错误；
C、质粒运载体通常是来自细菌，病毒没有质粒，C错误；
D．质粒运载体的化学本质是DNA，其复制和表达也遵循中心法则，D正确；
E．质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外并具有自我复制能力的双链环状DNA分子，不需要整合到受体细胞的DNA中，E错误。
故选AD。