凝乳酶是奶酪生产中的关键性酶，研究人员利用基因工程技术，将编码该酶的基因转移到了...

凝乳酶是奶酪生产中的关键性酶，研究人员利用基因工程技术，将编码该酶的基因转移到了微生物细胞中并使之表达。如图表示EcoRⅠ、BamHⅠ、PstⅠ三种限制酶在质粒和含凝乳酶基因的外源DNA片段上的切割位点．回答下列问题：

（1）根据图中EcoRⅠ、BamHⅠ、PstⅠ三种限制酶的切割位点分析，该工程中最不适宜用来切割外源DNA获取目的基因的限制酶是_____，将切割后的质粒和目的基因连接起来需要_____酶．构建好的重组质粒在目的基因前要加上特殊的启动子，它是_____识别和结合的部位。

（2）工业化生产过程中，若采用重组大肠杆菌生产凝乳酶，该过程中将目的基因导人大肠杆菌前，常常用_____处理细胞，使之处于一种能吸收周围环境中的DNA分子的生理状态，这种细胞称为_____细胞。

（3）研究发现，如果将该凝乳酶第20位和第24位氨基酸改变为半胱氨酸，其催化能力将提高2倍。科学家可以生产上述高效凝乳酶的现代生物工程技术是_____。该生物工程技术对蛋白质结构的设计和改造，必须通过基因来完成，原因是_____。

EcoRⅠ DNA连接酶 RNA聚合酶 Ca2+ 感受态蛋白质工程基因决定蛋白质【解析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因﹣﹣DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA﹣﹣分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质﹣﹣抗原﹣抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。（1）含有目的基因的外源DNA分子上含有EcoRⅠ、BamHⅠ、PstⅠ三种限制酶的切割位点，其中EcoRⅠ的切割位点位于目的基因上，用该酶切割会破坏目的基因，因此不能用该酶切割；将切割后的质粒和目的基因连接起来需要DNA连接酶．启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能启动转录过程。（2）将目的基因导入微生物细胞常用感受态细胞法，即用Ca2+处理细胞，使之处于一种能吸收周围环境中的DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。（3）生产上述高效凝乳酶需要对蛋白质进行改造，因此需要采用蛋白质工程技术；由于基因决定蛋白质，因此该生物工程技术对蛋白质结构的设计和改造，必须通过基因来完成。

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考点分析：

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阿尔茨海默是一种神经退行性疾病，科研人员为了探究发病机理和治疗方案，进行了如下研究。

（1）研究发现，患者脑部的神经元数量及神经元之间的_____（结构）明显减少。进一步研究证实这是由于神经元_____（填“胞体”、“树突”或“轴突”）内的核糖体上合成的β﹣淀粉样蛋白（Aβ）异常积累而引发细胞损伤导致。科研人员推断这种异常积累可能与_____Aβ的酶C表达量下降有关。

（2）科研人员提取正常人和患者的神经元DNA，对酶C基因进行测序，测序结果完全一致，说明酶C基因表达量的改变不是_____导致。

（3）科研人员分别提取正常人和患者神经元的酶C基因启动子的DNA片段，再分别用具有相同识别序列（CCGG）的HpaⅡ和MspⅠ酶切（但HpaⅡ不能切割甲基化的胞嘧啶）。结果显示正常人该DNA片段用MspⅠ切割后产生的片段数目与用HpaⅡ切割后产生的片段数目的差值_____（大于/小于）患者的相应差值，说明患者细胞中酶C基因启动子甲基化程度更高。