Question

近年来，化肥对农业生产的负面影响及对环境的污染日益引起人们的关注。由于固氮菌能固定大气中的氮气，提高土壤的氮含量，因而分离得到自生固氮菌（不与植物形成共生体）用以对土壤进行接种已成为一个新的研究方向。下表是微生物培养时常用的两种培养基，回答下列问题：

培养基甲	马铃薯	葡萄糖					琼脂	蒸馏水	pH
200g	20 g					15~20g	1000 ml	自然
培养基乙	甘露醇(或蔗糖、葡萄糖)	KH2PO4	MgSO4·7H2O	NaCl	CaSO4·2H2O	CaCO2	琼脂	水	pH
10g	0.2 g	0.2 g	0.2g	0.1 g	5g	20 g	1000 ml	自然

（1）分离固氮菌选用___(填“甲”或“乙”）培养基。从土壤深度看，选填____ ( “表层”或“深层”）的土壤容易得到自生固氮菌的菌种，获得的土样用______溶解后备用。

（2）接种前，将灭过菌的培养基放在37℃的恒温箱中培养24h，目的是______。

（3）用接种环蘸取少许稀泥浆，在培养基表面轻点15～20处，此操作过程中需对接种环进行______次灼烧灭菌。接好种的培养皿要在______处写明实验内容、接种人和日期。培养3～4天后可在接种的稀泥浆周围看到黏膜液状培养物，这是含有自生固氮菌的标志。

（4）某特定染液能使自生固氮菌着色，挑取黏液，用该染液染色后制成涂片，制成的涂片在______（填“低倍”或“高倍”）显微镜下观察固氮菌的形态特征。筛选到的菌落需进一步分离纯化，纯化自生固氮菌的培养接种方法最常用的两种是______。

Answer

乙 表层 无菌水 检验培养基灭菌是否合格 两 皿底 高倍 稀释涂布平板法、平板划线法

【解析】

分析表中两种培养基：乙培养基中无氮源，而甲培养基的马铃薯中含有碳源、氮源、水、无机盐等多种成分，分离固氮菌要用无氮培养基，因此，乙培养基更适合。在操作过程中要注意杂菌的污染，如培养基灭菌是否合格的检验、接种工具的灭菌等；在恒温箱中要倒置培养，因此，要在皿底处写明实验内容、接种人和日期。

（1）乙培养基中无氮源，而甲培养基的马铃薯中含有碳源、氮源、水、无机盐等多种成分，分离固氮菌要用无氮培养基，因此，乙培养基更适合。自生固氮菌的氮源来自空气，又是需氧型细菌，因此，在表层土壤中容易获得该菌。为了避免杂菌污染，获得的土壤要用无菌水溶解。

（2）培养基灭菌是否合格可通过将未接种的培养基在适合的条件下先行培养来检验。

（3）为了减少外来杂菌污染，在接种环蘸取泥浆前要进行灼烧灭菌，为了避免细菌污染环境和感染操作者，轻点稀泥浆结束后，还要进行灼烧灭菌。因为在恒温箱中要倒置培养，因此，要在皿底处写明实验内容、接种人和日期。

（4）挑取黏液用特定染液染色后再制成涂片，着色的为自生固氮菌，可在高倍显微镜下看清固氮菌的形态特征。微生物的接种方法中最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。