Question

凝乳酶是奶酪生产中的关键性酶，直接利用动、植物生产凝乳酶受多种因素限制，培育高酶活力凝乳酶微生物菌种是目前最有前途的发展方向。用紫外线照射芽孢杆菌，分离、培养，并检测各菌株所产生的凝乳酶活力，操作过程如图所示。请分析回答：

（1）图所示紫外线照射的原理是________，接种用的平板培养基________（是、不是）选择培养基。

（2）在一定温度下（35℃），一定时间内（通常为40分钟），凝固1mL10％脱脂奶粉的酶量为一个酶活力单位（U），凝乳酶活力检测结果如图2所示。

①据图所示，酶催化能力最强的是________组。

②A₂、A₅组酶活力单位与A₀组芽孢杆菌相同，两位同学对此做出了推测。

同学甲：A₂、A₅组芽孢杆菌未发生基因突变，因为基因突变具有________的特点。

同学乙：A₂、A₅组芽孢杆菌发生基因突变，但凝乳酶蛋白未改变，其依据的理由是________________。为了验证上述2位同学的假设，可采用________________技术检测凝乳酶基因是否发生了突变。

（3）从牛胃液中分离到的凝乳酶以催化能力强而被广泛应用，研究人员运用基因工程技术，将编码该酶的基因转移到了微生物细胞中。

①从牛胃细胞中提取________________，再反转录形成cDNA。以此cDNA为模板PCR扩增目的基因，有时需要在引物的起始端设计________（限制酶、DNA连接酶、RNA聚合酶）识别序列，以便构建重组DNA分子。

②构建重组DNA分子（如图所示）最好选用________________限制酶（填酶的名称），理由是________________。

③工业化生产过程中，最初多采用重组大肠杆菌或芽孢杆菌生产凝乳酶，现多采用重组毛霉生产，毛霉作为受体细胞的优势是___________________________________________________________________。

④研究发现，如果将该凝乳酶20位和24位氨基酸改变为半胱氨酸，其催化能力将提高2倍。通过蛋白质工程生产高效凝乳酶，所需步骤依次有________。

a．蛋白质的结构设计

b．蛋白质的结构和功能分析

c．蛋白质结构的定向改造

d．凝乳酶基因的定向改造

e．将改造后的凝乳酶基因导入受体细胞

f．将定向改造的凝乳酶导入受体细胞

Answer

基因突变 不是 A6 低频率性（稀有性） 一种氨基酸可能对应多种密码子（基因突变发生在非编码区或密码子有简并性） DNA分子杂交（DNA测序） mRNA 限制酶 BamHⅠ和PstⅠ 提高重组DNA分子的比例（防止自身的黏性末端连接，防止目的基因与载体反向连接） 含有内质网和高尔基体，可对蛋白质进行加工和修饰 b、a、d、e

【解析】

本题结合图示主要考查基因工程的原理及技术、基因工程的应用、蛋白质工程等。据图第一个图所示的b过程为菌落的稀释，培养基中含有多种酶活力不同的突变芽孢杆菌；第二个图中，凝固1mL10%脱脂奶粉的酶量最少的是6组；分析第三个图可知，质粒和外源DNA中共同含有且不会破坏目的基因的限制酶是BamHI和PstI。

（1）图所示紫外线照射使细胞中的基因发生改变，其原理是基因突变；接种用的平板培养基为不管突变与否的芽孢杆菌提供营养物质的，不用于筛选，故不是选择培养基。

（2）①据图2所示，凝固1mL10%脱脂奶粉的酶量最少的是A6组，故酶催化能力最强的是A6组。②同学甲：基因突变有低频性的特点，故很可能使A2、A5组的细菌均未发生基因突变。同学乙：如果A2、A5组芽孢杆菌发生基因突变，但凝乳酶蛋白未改变，这可能是因为一种氨基酸可能对应多种密码子，随基因发生突变，但不会改变翻译出来的氨基酸；也可能是因为发生基因突变的区段为非编码区。为了验证上述2位同学的假设，可采用DNA分子杂交技术检测凝乳酶基因是否发生了突变。

（3）①牛胃细胞中含有能翻译出凝乳酶的mRNA，可逆转录得到cDNA．构建重组DNA分子时，需用同种限制性内切酶处理目的基因和载体，故需要在引物的5’端设计限制酶识别序列，以便构建重组DNA分子。
②由图3可知，质粒和外源DNA中共同含有且不会破坏目的基因的限制酶是BamHI和PstI，因此构建重组DNA分子最好选用BamHI和PstI限制酶，这样可以防止自身的黏性末端连接，防止目的基因与载体反向连接。
③毛霉较重组大肠杆菌或芽孢杆菌作为受体细胞的优势是毛霉为真核微生物，含有内质网和高尔基体可对蛋白进行加工和修饰。

④通过分析想要的蛋白质的功能，预测蛋白质应有的结构，然后根据蛋白质的结构逆向推测控制该蛋白质合成的基因的碱基组成及排列顺序．最后就是将改造后的目的基因导入受体细胞，从而转录翻译得出目的蛋白，故顺序为b、a、d、e。